Test d'aptitude d'un robot de pipetage pour la production stérile

Hamilton Microlab Star en salle blanche ISO 1 du Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star dans la salle blanche ISO 1 du Fraunhofer IPA. Source de l'image : Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star en salle blanche ISO 1 du Fraunhofer IPA lors d'une visualisation d'écoulement. Source de l'image : Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star en salle blanche ISO 1 du Fraunhofer IPA lors d'une visualisation du flux d'air. Source de l'image : Fraunhofer IPA

Plaques de sédimentation PCA déployées pour la mesure des micro-organismes sédimentés dans un Hamilton Microlab Star. Source de l'image : Fraunhofer IPA

Galets de silicium disposés pour la mesure des particules sédimentées dans un Hamilton Microlab Star. Source de l'image : Fraunhofer IPA

Contenu :
1           Introduction   
2          Définition des tests nécessaires   
3          Tests effectués   
3.1       Mesure de la propreté particulaire de l'air aux points de contrôle critiques   
3.2       Visualisation du flux d'air   
3.3       Simulation de remplissage média   
3.4       Mesure du risque de contamination au niveau du produit   
3.4.1    Risque de contamination microbiologique   
3.4.2    Risque de contamination particulaire   
4          Résumé   
5        Perspectives   
6          Bibliographie   

1     Introduction
Les machines et équipements utilisés dans la production de médicaments stériles doivent répondre à des exigences strictes. Il doit être assuré qu’un équipement utilisé ne constitue à aucun moment un danger pour le produit lors d’une production stérile en cours. Dans la production stérile d’une industrie pharmaceutique, qui doit respecter les directives de l’EU-GMP Annexe 1 (1), la contamination particulaire et la charge microbiologique jouent un rôle déterminant. Lors du remplissage d’ampoules ouvertes avec des parenteraux liquides, il faut garantir qu’aucune particule ni micro-organisme ne pénètre dans l’ampoule pendant le processus de remplissage. La validation des installations pour une production stérile comprend notamment le « Media Fill » selon l’EU-GMP Annexe 1. Lors de cette étape, une solution nutritive microbiologique est remplie dans un certain nombre d’ampoules à la place du produit. Après incubation, la stérilité de chaque contenant est déterminée.

Une grande partie des micro-organismes transportés par l’air sont liés à des particules comprises entre 10 et 20 µm. En principe, une réduction des particules en suspension dans l’air entraîne également une réduction correspondante des micro-organismes en suspension (2). Cela souligne, en plus du suivi microbiologique, la nécessité de mesures supplémentaires de détection des émissions de particules pour une évaluation complète des risques. Il s’agit de déterminer les particules en suspension dans l’air émises par l’installation lors de son fonctionnement, dues à l’usure ou aux frottements entre différents matériaux. Comme toutes les particules en suspension ne représentent pas nécessairement un danger réel pour le produit, des particules sédimentées dans le produit sont également mesurées. Une visualisation supplémentaire du flux d’air permet de mieux comprendre la circulation de l’air dans l’installation et peut également contribuer à l’évaluation des risques.

Ce rapport présente une évaluation complète et exemplaire de la conformité d’une installation pour la production pharmaceutique stérile. L’installation testée est un robot de pipetage de la série Microlab Star de la société Hamilton Bonaduz AG, Suisse. Le système a déjà été utilisé pendant deux ans en environnement de laboratoire normal au moment du test. Afin d’obtenir une analyse fiable de l’état actuel du robot de pipetage, celui-ci n’a pas été modifié pour une production stérile ultérieure. Selon les résultats, une optimisation ciblée, si nécessaire, pourra être effectuée pour garantir une utilisation sûre en environnement de production stérile.

2     Définition des tests nécessaires
La base de cette démarche est l’Annexe 1 de l’EU-GMP en vigueur, qui est explicitement requise pour la fabrication de médicaments stériles. Elle prévoit des mesures pour minimiser le risque de contamination microbiologique, particulaire et pyrogène (voir chapitre « Principles » du guide).

La classe de propreté de l’air exigée doit être maintenue même pendant le fonctionnement de l’installation. Par exemple, lors du dosage d’un médicament stérile dans un processus ouvert, l’environnement immédiat du processus doit respecter la classe de protection GMP A, équivalente à la classe de propreté ISO 5 selon ISO 14644-1 (3). Les sections 4 à 19 du guide EU-GMP Annexe 1 détaillent ces exigences. --> Mesure de la propreté particulaire de l’air aux points de contrôle critiques.

La classe de protection GMP A comprend généralement un flux d’air laminaire avec une vitesse comprise entre 0,36 et 0,54 m/s. Le guide EU-GMP recommande, dans le chapitre 3, un contrôle et une validation du flux laminaire pendant le fonctionnement. --> Visualisation du flux d’air.

La validation d’un processus aseptique inclut toujours un « Media Fill » (voir section 66 du guide EU-GMP Annexe 1). Il consiste à remplacer le produit liquide par une solution nutritive. Les contenants remplis sont ensuite scellés et incubés. En cas de contamination microbiologique, celle-ci se développerait dans le milieu nutritif, rendant le contenu visible après incubation. Pour une conclusion valable, aucune contamination ne doit apparaître dans 5000 contenants. Si un seul est contaminé, le Media Fill doit être répété après une analyse approfondie des causes (voir section 69 du guide EU-GMP Annexe 1). --> Simulation de remplissage média.

Les différentes pharmacopées fixent des limites pour la charge particulaire dans les médicaments parenteraux stériles (4) (5). Le risque de contamination particulaire est évalué en mesurant les particules sédimentées sur des wafers de silicium à l’endroit de la manipulation du produit ouvert. --> Risque de contamination particulaire. La quantité et la distribution de taille des particules sédimentées dans le produit sont déterminées. La même méthode est appliquée sur des plaques de sédimentation PCA pour évaluer le --> risque de contamination microbiologique.

Les tests détaillés sont décrits ci-après. Le système a été introduit dans la salle propre de classe ISO 1 selon ISO 14644-1 du Fraunhofer IPA après nettoyage. (3). La couverture du robot de pipetage a été enlevée, créant ainsi un système à accès restreint (RABS), comme illustré à la figure 1. L’accès au niveau du produit était uniquement possible par une ouverture sous le couvercle. Le couvercle peut être ouvert pour la maintenance, mais reste fermé en fonctionnement normal.

3     Tests effectués
3.1     Mesure de la propreté particulaire de l’air aux points de contrôle critiques
Les points de contrôle critiques ont été choisis directement sous le bras robotique (MP01 à MP03). Un point de mesure (MP04) a enregistré l’air extrait sous la porte de service fermée pendant la mesure. Les mesures et analyses ont été effectuées selon la directive VDI 2083 Blatt 9.1 (6). Quatre compteurs de particules LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, États-Unis, ont été utilisés. La méthode de mesure représentative consistait à remplir, mélanger et doser des liquides dans des plaques multi-poches.

Tous les points de mesure ont atteint, avec une certitude statistique de 99,9 %, la classe de propreté ISO 4 selon ISO 14644-1. Ainsi, tous les points répondent aisément aux exigences de l’EU-GMP Annexe 1 concernant la propreté particulaire de l’air ambiant lors de processus stériles ouverts.

3.2     Visualisation du flux
Pour la visualisation du flux d’air, un générateur de brouillard d’eau ultrapure est utilisé. Il produit un brouillard très fin, bien visible, qui s’évapore sans résidu après condensation éventuelle sur les surfaces. Des séquences vidéo prises lors d’un processus de pipetage en cours ont montré que la direction principale du flux d’air, partant du plafond du local propre, était toujours respectée par l’appareil. Aucun point de stagnation ni de circulation contraire au flux principal n’a été observé. Lorsque les canaux de pipetage du Microlab Star étaient suffisamment espacés, le flux d’air circulait librement entre eux. La visualisation a également montré que, dans la plupart des cas, les particules générées par les canaux de pipetage sont évacuées par le flux d’air et n’atteignent pas la surface du produit.

3.3     Simulation de remplissage média
Pour la simulation de remplissage média, un liquide nutritif stérilisé a été placé dans des contenants stériles, puis transféré dans des plaques multi-poches de 96 puits, en utilisant une méthode représentative de pipetage, et mélangé avec d’autres solutions nutritives. Après dosage final dans les plaques, celles-ci ont été scellées avec un couvercle stérile, extraites de la salle propre et incubées selon les prescriptions du milieu nutritif utilisé. Après incubation, chaque puits a été examiné. Si une turbidité était détectée, cela indiquait une contamination microbienne. Sur les 5376 puits traités, aucun ne montrait de turbidité visible après incubation prolongée. Même après une incubation prolongée, aucune croissance bactérienne ou fongique n’a été observée. Cela montre que le robot de pipetage testé peut, en principe, réaliser un remplissage média aseptique conforme à l’EU-GMP Annexe 1, à condition qu’il soit utilisé dans une salle propre de classe GMP A ou ISO 5 ou mieux. Le fait que le système n’ait pas été stérilisé par traitement à la vapeur d’eau ou par formaldéhyde avant la simulation, mais uniquement nettoyé avec de l’alcool isopropylique à 70 %, constitue une « situation de pire cas ». La stérilisation par traitement à la vapeur ultérieur lors du processus aseptique inactivera toute contamination microbiologique initiale sur les surfaces, ne laissant apparaître que d’éventuels particules pyrogènes.

3.4     Mesure du risque de contamination au niveau du produit
Une contamination particulaire ou microbiologique réelle du produit ne se produit que lorsque des particules ou micro-organismes atteignent le flacon, l’ampoule ou le puits par sédimentation ou impact. Pour simuler cette contamination, des mesures ont été effectuées dans la zone de produit ultérieure.

3.4.1     Risque de contamination microbiologique
Pour simuler ce risque, des plaques de sédimentation (plaques PCA, agar de comptage stérile, diamètre 55 mm) ont été placées dans la zone de produit ultérieure aux positions critiques. La procédure de pipetage exemplaire a été répétée quatre fois, ce qui correspond à une durée d’exposition d’environ deux heures. Une exposition plus longue pour augmenter la sensibilité de détection n’est pas recommandée en raison du risque de dessèchement des plaques. Après incubation, aucune colonie n’a été détectée sur aucune plaque. La capacité des plaques PCA à cultiver des micro-organismes en suspension dans l’air a été confirmée par un contrôle positif en laboratoire normal. Aucun risque de contamination microbiologique par micro-organismes sédimentés ou impactés n’a été détecté lors de quatre essais. Cette étude confirme le résultat du test de remplissage média.

3.4.2     Risque de contamination particulaire
Pour simuler ce risque, des wafers de silicium de 100 mm de diamètre ont été placés dans la zone de produit ultérieure. Pourquoi des wafers de silicium ? Parce que ces substrats parfaitement lisses sont équipés de systèmes de mesure entièrement automatisés permettant de déterminer rapidement la concentration en nombre et la distribution de taille de toutes les particules sédimentées ou impactées. Au Fraunhofer IPA, l’appareil Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, États-Unis) a été utilisé. Toutes les mesures ont été réalisées dans la salle propre de classe ISO 1. Après avoir défini le nombre de cycles de manipulation nécessaires pour une mesure fiable, deux cycles ont été effectués. La contamination particulaire des surfaces des wafers a été mesurée avant et après le nombre défini de cycles. Les résultats ont été rapportés à la surface exposée d’un seul puits de la plaque multi-poches de 96. La probabilité de contamination par un seul particule comprise entre 0,21 et 7,7 µm est de 0,05 % par puits. Pour une particule entre 1,4 et 63 µm, la probabilité est de 0,04 % par puits.

Que signifient ces chiffres par rapport aux limites définies ? Pour les particules > 10 µm, le Pharmacopée Européenne, dans le chapitre 2.9.19, fixe une limite admissible de 6000 particules (5). La probabilité que, lors d’un processus de pipetage de 30 minutes, deux particules de la plage de taille entre 1,4 et 63 µm pénètrent dans le même puits ouvert est inférieure à une chance sur un million ! Ainsi, un puits durant un processus de pipetage ne dépassera jamais, statistiquement, la limite fixée de 6000 particules > 10 µm, uniquement en tenant compte des particules générées par le robot. Bien sûr, cela n’inclut pas les particules déjà présentes dans le puits en tant que contamination initiale. On suppose un puits parfaitement propre et un environnement de salle blanche ISO 1 optimal.

4     Résumé
Toutes les investigations menées ont confirmé la compatibilité fondamentale du robot de pipetage Hamilton Microlab Star pour la production stérile de médicaments parenteraux. Aucun risque de contamination pour le produit testé n’a été détecté.

Particules en suspension : Si l’environnement de la salle blanche d’installation ultérieure répond aux exigences de l’EU-GMP Annexe 1 et de l’ISO 14644-1, le fonctionnement du robot de pipetage Hamilton Microlab Star ne dégradera pas la qualité de l’environnement. Une zone GMP A, en tant que classe la plus élevée en production stérile, sera maintenue même sous les canaux de pipetage.

Contamination microbiologique : Aucun risque microbiologique n’a été détecté lors du test de remplissage média ni par l’utilisation de plaques PCA.

Particules sédimentées : La probabilité qu’un puits ouvert ou un flacon soit contaminé par une particule émise par l’installation est extrêmement faible. La limite réglementaire fixée par les pharmacopées n’est jamais atteinte ou dépassée statistiquement.

Visualisation du flux : La maintenance du flux laminaire et de la direction du flux d’air principal, exigée en environnement GMP A, ainsi que la recommandation de séparation du personnel du produit ouvert, sont respectées par le robot de pipetage Hamilton Microlab Star. Cela est assuré par les parois séparant le flux d’air, l’entrée d’air par le toit ouvert du boîtier, et l’évacuation d’air sous le châssis, en dessous du niveau du produit, à l’avant et à l’arrière. Le bras robot, auquel sont fixés les canaux de pipetage, n’affecte la laminarité qu’à proximité immédiate, tout en maintenant en permanence la direction du flux d’air.

5     Perspectives
Chaque environnement de fabrication présente un spectre spécifique de particules et micro-organismes, influencé principalement par les conditions ambiantes et le personnel. Une évaluation préalable ne peut pas simuler la contamination ultérieure spécifique. Cela souligne la nécessité de réaliser, après l’installation, un test complet de remplissage média selon l’EG-GMP Annexe 1, avec tous les paramètres futurs. La méthode présentée ici ne peut pas remplacer cette étape. Elle illustre uniquement une approche pour une évaluation de principe d’une installation pour applications aseptiques.

6     Références

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Fabrication de médicaments stériles. Bruxelles : Commission européenne, 2003.

2. USP 35 Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. The United States Pharmacopeia. Rockville MD : United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Salles propres et zones de salles propres associées - Partie 1 : Classification de la propreté de l’air. Berlin : Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD : United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19 : Particulate Contamination : particules invisibles. Pharmacopée européenne, 7e édition. Strasbourg : European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Reinraumtechnik - Reinheitstauglichkeit und Oberflächenreinheit. Berlin : Beuth Verlag, 2006.