Geschiktheidsprüfung van een pipetteerrobot voor de steriele productie

Hamilton Microlab Star in ISO 1 cleanroom van Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in ISO 1 Cleanroom van Fraunhofer IPA. Beeldbron: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in ISO 1 Reinraum des Fraunhofer IPA während einer Strömungsvisualisierung. Bildquelle: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star in de ISO 1 cleanroom van Fraunhofer IPA tijdens een stromingsvisualisatie. Beeldbron: Fraunhofer IPA

Uitgelegde PCA-sedimentatieplaten voor het meten van gesedimenteerde micro-organismen in een Hamilton Microlab Star. Beeldbron: Fraunhofer IPA

Uitgelegde silicium-wafers voor het meten van sedimentaire deeltjes in een Hamilton Microlab Star. Beeldbron: Fraunhofer IPA

Inhoud:
1       Inleiding   
2       Afleiding van de noodzakelijke testen   
3       Uitgevoerde testen   
3.1      Meting van de partikulaire luchtzuiverheid op kritieke controlepunten   
3.2      Stromingsvisualisatie   
3.3      Media Fill simulatie   
3.4      Meting van het contaminatierisico op productniveau   
3.4.1    Microbiologisch contaminatierisico   
3.4.2    Particulier contaminatierisico   
4       Samenvatting   
5       Toekomstperspectief   
6       Literatuurlijst   

1    Inleiding
Machines en installaties die worden ingezet bij de productie van steriele farmaceutische producten, moeten voldoen aan strenge eisen. Het moet worden verzekerd dat een gebruikte uitrustingsonderdeel op geen enkel moment tijdens de lopende steriele productie een gevaar voor het product vormt. In de sterielproductie van een farmaceutische industrie, die volgens de richtlijnen van EU-GMP Annex 1 (1) moet werken, speelt naast partikelcontaminaties ook de microbiologische belasting een cruciale rol. Wanneer open ampullen met vloeibare parenteralia worden gevuld, moet worden verzekerd dat tijdens het vulproces geen deeltjes en micro-organismen uit de installatie in de ampul terechtkomen. Voor de validatie van installaties voor steriele productie hoort onder andere de zogenaamde 'Media Fill' volgens EU-GMP Annex 1. Hierbij wordt exemplarisch in plaats van het product een microbiële voedingsoplossing in een bepaald aantal ampullen gevuld. Na succesvolle incubatie van de containers wordt de steriliteit van elk afzonderlijk container vastgesteld.

Een groot deel van de luchtgedragen micro-organismen is gebonden aan deeltjes tussen 10 en 20 µm. In principe gaat een vermindering van luchtgedragen deeltjes gepaard met een overeenkomstige vermindering van luchtgedragen micro-organismen (2). Dit onderstreept, naast microbiologisch monitoring, de noodzaak van aanvullende deeltjesemissiemetingen voor een volledige risico-evaluatie. Daarbij gaat het erom de luchtgedragen deeltjes te bepalen die tijdens de bedrijfsvoering uit de installatie treden door slijtage en wrijving tussen verschillende materiaalkoppelingen. Omdat niet alle luchtgedragen deeltjes later een daadwerkelijke bedreiging voor het product vormen, worden daarnaast ook sedimenterende deeltjes op productniveau bepaald. Een aanvullende stromingsvisualisatie verduidelijkt de luchtstroom in de installatie en kan eveneens worden gebruikt voor de risico-evaluatie.

In dit rapport wordt een volledige exemplarische geschiktheidstest van een installatie voor de farmaceutische steriele productie gepresenteerd. De geteste installatie betreft een pipetteerrobot van de serie Microlab Star van het bedrijf Hamilton Bonaduz AG, Zwitserland. Het systeem werd op het moment van de test al twee jaar in een normale laboratoriumomgeving gebruikt. Om een betrouwbare analyse van de huidige toestand van de pipetteerrobot te verkrijgen, werd het systeem niet aangepast voor een latere beoogde steriele productie. Afhankelijk van de resultaten kan zo nodig een gerichte optimalisatie worden uitgevoerd voor een veilige inzet in steriele productieomgevingen.

2    Afleiding van de noodzakelijke testen
Als basis hiervoor dient de actuele EU-GMP Annex 1, die expliciet voorschrijft voor de fabricage van steriele geneesmiddelen. Deze vereist maatregelen om het risico van microbiële, partikel- en pyrogene contaminatie te minimaliseren (zie hoofdstuk 'Principles' van de leidraad).

De vereiste luchtzuiverheidsklasse moet zelfs tijdens de bedrijfsvoering worden gehandhaafd. Bijvoorbeeld, wanneer in een open proces een steriel medicijn wordt gedoseerd, geldt voor de ruimte rondom de doseerstap de beschermklasse GMP A, wat ongeveer overeenkomt met de luchtzuiverheidsklasse ISO 5 volgens ISO 14644-1 (3). In secties 4 tot 19 van de EU-GMP leidraad Annex 1 wordt hier gedetailleerd op ingegaan. --> Meting van de partikulaire luchtzuiverheid op kritieke controlepunten.

De beschermklasse GMP A omvat meestal een laminaire luchtstroom met een snelheid tussen 0,36 en 0,54 m/s. De EU-GMP-leidraad beveelt in hoofdstuk 3 een controle en validatie van de laminaire luchtstroom tijdens de bedrijfsvoering aan. --> Stromingsvisualisatie.

De validatie van een aseptisch proces omvat altijd een zogenaamde Media Fill (zie sectie 66 in de EU-GMP Annex 1 leidraad). Hierbij wordt het hanteren van een vloeibaar farmaceutisch product vervangen door een voedingsoplossing. De gevulde containers worden vervolgens afgesloten en geïncubeerd. Als er een microbiële contaminatie heeft plaatsgevonden, zou deze in het voedingsmedium groeien en na voldoende incubatietijd duidelijk zichtbaar troebel worden. Om een valide uitspraak te kunnen doen, mag bij 5000 containers geen enkel besmet exemplaar voorkomen. Als er slechts één besmet is, moet na een succesvolle foutenanalyse de volledige Media Fill worden herhaald (zie sectie 69 in de EU-GMP leidraad Annex 1). --> Media Fill simulatie.

De verschillende farmacopees schrijven voor steriele parenteralia grenswaarden voor een mogelijke partikelbelasting voor (4) (5). Hoe hoog het risico op zo'n partikelbelasting kan zijn, wordt bepaald door metingen van op siliciumwafer sedimenterende deeltjes op de plek van de open producthandling. --> Particulier contaminatierisico. Hierbij wordt de hoeveelheid en de grootteverdeling van de sedimenterende deeltjes op productniveau vastgesteld. Dezelfde methode wordt toegepast op sedimentatieplaten met Plate Count Agar (PCA) om het --> microbiologische contaminatierisico te bepalen.

Hieronder wordt gedetailleerd ingegaan op de afzonderlijke testen. Het systeem werd hiervoor in de meetruimte van klasse ISO 1 volgens ISO 14644-1 van het Fraunhofer IPA gebracht na reiniging (3). Het dak van de pipetteerrobot werd verwijderd, waardoor een soort RABS (Restricted Access Barrier System) werd gecreëerd, zoals te zien in figuur 1. Toegang tot het productniveau was principieel alleen mogelijk via een open ingreep onder de klep. De klep kan voor service worden geopend, maar blijft tijdens normaal gebruik gesloten.

3    Uitgevoerde testen
3.1    Meting van de partikulaire luchtzuiverheid op kritieke controlepunten
Als kritieke controlepunten werden hier punten direct onder de robotarm gekozen (MP01 tot MP03). Een meetpunt (MP04) registreerde de afzuiglucht die onder de tijdens de meting gesloten serviceklep uitmondde. De metingen en evaluaties werden uitgevoerd volgens de richtlijn VDI 2083 blad 9.1 (6). Er werden vier partikelsensoren gebruikt, namelijk LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, Verenigde Staten. Voor de meting werd een representatieve methode gebruikt voor het vullen, mengen en doseren van vloeistoffen in multi-well platen.

Alle meetpunten bereikten met een statistische zekerheid van 99,9 % de luchtzuiverheidsklasse ISO 4 volgens ISO 14644-1. Daarmee voldoen alle meetpunten moeiteloos aan de eisen van de EU-GMP Annex 1 met betrekking tot de partikulaire zuiverheid van de omgevingslucht tijdens open steriele processen.

3.2    Stromingsvisualisatie
Voor de stromingsvisualisatie wordt een nevelgenerator met zuiver water gebruikt. Deze produceert een fijne, zeer goed zichtbare nevel die na eventuele condensatie op oppervlakken weer verdampt zonder resten achter te laten. Door het opnemen van verschillende filmfragmenten tijdens een lopend pipetteerproces is aangetoond dat de primaire stromingsrichting uitgaande van het filterdak van de cleanroom via het apparaat naar de zijkant en onder altijd werd gehandhaafd. Er waren geen opstuwgebieden en geen luchtstromingen tegen de primaire luchtstroom in. Zodra de afzonderlijke pipetteerkanalen van de Microlab Star voldoende uit elkaar lagen, kon de luchtstroom ongehinderd tussen de kanalen circuleren. Door de stromingsvisualisatie werd ook duidelijk dat de door de kanalen gegenereerde deeltjes in de meeste gevallen door de luchtstroom uit de installatie worden verwijderd en niet op het productniveau op de oppervlakken impacteren.

3.3    Media Fill simulatie
Voor de uitvoering van de Media Fill simulatie werd in de steriele voorraadvaten een steriele voedingsoplossing gebracht, die via een representatieve pipetteermethode in steriele 96-well platen werd gevuld en gemengd met aanvullende voedingsoplossing. Na de uiteindelijke dosering werden deze platen met een steriel deksel afgesloten, uit de cleanroom verwijderd en volgens de voorschriften van het gebruikte voedingsmedium geïncubeerd. Na de incubatie werden de individuele wells onderzocht. Als er troebelheid werd vastgesteld, duidt dat op microbiële contaminatie. Bij de beoordeling van alle 5376 verwerkte wells werd geen enkele well met zichtbare troebelheid gevonden na voldoende lange incubatie. Zelfs na verlenging van de incubatietijd vertoonde geen enkele wel groei van bacteriën of schimmels. Hiermee is aangetoond dat de onderzochte pipetteerrobot in principe een aseptische Media Fill volgens EU-GMP Annex 1 succesvol kan doorstaan, mits deze zich in een GMP A- of ISO 5- of betere cleanroom bevindt. Vooral doordat het systeem vóór de uitgevoerde Media Fill simulatie niet werd gesteriliseerd met waterstofperoxide of formaline, maar alleen de toegankelijke oppervlakken met een eenvoudige doekdesinfectie met 70% isopropanol werden behandeld, kan de uitgevoerde Media Fill simulatie worden beschouwd als een 'worst case scenario'. Door een later in het aseptische proces noodzakelijke gesteriliseerde gasbehandeling wordt de mogelijk aanwezige microbiële contaminatie op de oppervlakken geïnactiveerd en kan alleen nog als mogelijke pyrogene deeltjes optreden.

3.4    Meting van het contaminatierisico op productniveau
Een daadwerkelijke partikel- of microbiële productcontaminatie treedt pas op wanneer de deeltjes of micro-organismen via sedimentatie of impact in het vials, ampullen of wells terechtkomen. Om deze contaminatie te simuleren, werden later op productniveau metingen uitgevoerd.

3.4.1    Microbiologisch contaminatierisico
Voor de simulatie van het microbiologische contaminatierisico werden sedimentatieplaten (Steriele Plate Count Agar PCA-platen met 55 mm diameter) op de kritieke posities in het productniveau geplaatst. De exemplaire pipetteeractie werd viermaal uitgevoerd, wat neerkomt op een blootstellingsduur van ongeveer twee uur. Een langere blootstelling voor verhoogde detectiegevoeligheid wordt vanwege mogelijk uitdrogen van de platen niet aanbevolen. Na de incubatie werden de PCA-platen visueel beoordeeld op zichtbare kolonies. Geen enkele plaat vertoonde kolonies. Een positieve controle in een normale laboratoriumomgeving bevestigde de capaciteit van de PCA-platen om luchtgedragen micro-organismen te cultiveren. Daarmee kon geen microbiologisch contaminatierisico door sedimenterende of impacterende micro-organismen op productniveau tijdens vier runs worden vastgesteld. Deze bevinding bevestigt de uitkomsten van de Media Fill-test.

3.4.2    Particulier contaminatierisico
Voor de simulatie van het particuliere contaminatierisico werden siliciumwafer met een diameter van 100 mm in het productniveau geplaatst. Waarom siliciumwafer? Voor deze perfect vlakke substraten bestaan volledig geautomatiseerde meetsystemen die in korte tijd de hoeveelheid en grootteverdeling van sedimenterende of impacterende deeltjes kunnen bepalen. Bij het Fraunhofer IPA werd hiervoor het meetinstrument Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, Verenigde Staten) gebruikt. Alle metingen werden eveneens in de klasse ISO 1 cleanroom uitgevoerd. Na vaststelling van de benodigde handlingcycli voor een succesvolle meting werden twee meetcycli uitgevoerd. Daarbij werd de partikulaire belasting van de oppervlakken van de siliciumwafer vóór en na de vastgestelde hoeveelheid handlingcycli gemeten. De meetresultaten werden omgerekend naar de geëxposeerde oppervlakte van een enkele well van de 96-well plaat. Voor een enkel deeltje tussen 0,21 en 7,7 µm werd een contaminatiewaarschijnlijkheid van 0,05% per well berekend. Voor een enkel deeltje tussen 1,4 en 63 µm werd een contaminatiewaarschijnlijkheid van 0,04% per well vastgesteld.

Wat betekent deze waarde in relatie tot de vastgestelde grenswaarden? Voor deeltjes > 10 µm definieert het Europese farmacoepische boek in hoofdstuk 2.9.19 de toegestane grenswaarde van 6000 deeltjes (5). De kans dat tijdens een pipetteerproces van 30 minuten in hetzelfde open well twee deeltjes tussen 1,4 en 63 µm terechtkomen, ligt op meer dan één op een miljoen! Daarmee zal een well tijdens een pipetteerproces statistisch nooit de vastgestelde grens van 6000 deeltjes > 10 µm overschrijden, uitsluitend door de door de robot gegenereerde deeltjes. Uiteraard worden hierbij niet de deeltjes meegeteld die al vooraf als contaminatie in het well aanwezig waren. Er wordt uitgegaan van een perfect schone well en een optimale cleanroomomgeving ISO 1.

4    Samenvatting
Alle uitgevoerde onderzoeken tonen de principegeschiktheid van de onderzochte pipetteerrobot Hamilton Microlab Star voor de steriele productie van parenteralia. Er kon geen contaminatierisico voor het verwerkte product worden vastgesteld.

Luchtgedragen deeltjes: Als de cleanroomomgeving bij latere installatie voldoet aan de eisen van EU-GMP Annex 1 en ISO 14644-1, zal de werking van de Hamilton Microlab Star tijdens gebruik de cleanroomomgeving niet verslechteren door mogelijke deeltjesemissie. Een GMP A-omgeving als hoogste klasse in steriel productie wordt ook onder de onderkant van de pipetteerkanalen probleemloos gehandhaafd.

Microbiële contaminatie: Een microbiologisch risico kon zowel in de uitgevoerde Media Fill als door het gebruik van PCA-sedimentatieplaten niet worden vastgesteld.

Sedimenterende deeltjes: De kans dat een open well of een open vial wordt verontreinigd door een door de installatie uitgezonden deeltje is uiterst gering. De in de farmacoepische boeken gestelde grenswaarde wordt daarbij statistisch nooit bereikt of overschreden.

Stromingsvisualisatie: Het in GMP A-omgevingen vereiste behoud van laminariteit en richting van de primaire luchtstroom en de aanbeveling om personeel van het open product te scheiden, wordt door de pipetteerrobot Hamilton Microlab Star nageleefd. Dit wordt bereikt door de afscheidende wanden, de luchtinlaat via het open dak van de behuizing en de luchtuitlaat onder het chassis onderaan en vooraan bij het productniveau. De robotarm, waaraan de pipetteerkanalen bewegelijk zijn bevestigd, beïnvloedt de laminariteit slechts in de directe omgeving, maar de stromingsrichting van de lucht blijft voortdurend gehandhaafd.

5    Toekomstperspectief
Elke productieomgeving vertoont een eigen spectrum aan deeltjes en micro-organismen met specifieke probleemkiemen, die vooral worden beïnvloed door de omgevingsomstandigheden en het personeel. Een voorafgaande geschiktheidscontrole kan dus niet het latere contaminatiespectrum simuleren. Dit onderstreept de eis dat na installatie van een installatie in een aseptische productielijn een volledige Media Fill volgens EG-GMP Annex 1 met alle later gebruikte parameters moet worden uitgevoerd. De hier beschreven geschiktheidscontrole kan hiervoor niet worden gebruikt. Ze toont slechts een methodiek voor de principegeschikte beoordeling van een installatie voor aseptische toepassingen.

6    Literatuurlijst

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Fabricage van steriele geneesmiddelen. Brussel: Europese Commissie, 2003.

2. USP 35 Microbiologische Evaluatie van Clean Rooms en andere gecontroleerde omgevingen. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Cleanrooms en bijbehorende cleanroomgebieden - Deel 1: Classificatie van de luchtzuiverheid. Berlijn: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Particulate Contamination: sub-visible particles. Europese Farmacopee, 7e editie. Straatsburg: Europees directoraat voor de kwaliteit van geneesmiddelen en gezondheidszorg, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Reinraumtechniek - Reinheidseisen en oppervlaktereinigheid. Berlijn: Beuth Verlag, 2006.