Egzamin kompetencyjny robota pipetującego do produkcji sterylnej

Hamilton Microlab Star w ISO 1 w czystym pomieszczeniu Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star w ISO 1 w pomieszczeniu czystym Fraunhofer IPA. Źródło obrazu: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star w ISO 1 czystym pomieszczeniu w Fraunhofer IPA podczas wizualizacji przepływu. Źródło obrazu: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star w ISO 1 czystym pomieszczeniu Fraunhofer IPA podczas wizualizacji przepływu. Źródło obrazu: Fraunhofer IPA

Rozłożone płyty sedymentacyjne PCA do pomiaru osiadłych mikroorganizmów w Hamilton Microlab Star. Źródło obrazu: Fraunhofer IPA

Rozłożone wafle krzemowe do pomiaru osadzonych cząstek w Hamilton Microlab Star. Źródło obrazu: Fraunhofer IPA

Spis treści:
1       Wstęp   
2       Wyprowadzenie niezbędnych badań   
3       Przeprowadzone badania   
3.1      Pomiar czystości powietrza w krytycznych punktach kontrolnych   
3.2      Wizualizacja przepływu   
3.3      Symulacja Media Fill   
3.4      Pomiar ryzyka kontaminacji na poziomie produktu   
3.4.1    Ryzyko kontaminacji mikrobiologicznej   
3.4.2    Ryzyko kontaminacji cząsteczkowej   
4       Podsumowanie   
5       Perspektywy rozwoju   
6       Bibliografia   

1 Wstęp
Maszyny i urządzenia wykorzystywane w produkcji sterylnych farmaceutyków muszą spełniać rygorystyczne wymagania. Należy zapewnić, że używany sprzęt nie stanowi zagrożenia dla produktu w żadnym momencie ciągłej produkcji sterylnej. W produkcji sterylnej przemysłu farmaceutycznego, który musi działać zgodnie z wytycznymi EU-GMP Annex 1 (1), oprócz kontaminacji cząsteczkowej kluczową rolę odgrywa obciążenie mikrobiologiczne. Podczas napełniania otwartych ampułek płynnymi preparatami parenteralnymi musi być zapewnione, że podczas procesu napełniania do ampułek nie dostają się cząstki ani mikroorganizmy z urządzenia. Walidacja urządzeń do produkcji sterylnej obejmuje między innymi tzw. „Media Fill” zgodnie z EU-GMP Annex 1. Polega ona na napełnianiu próbki mikrobiologicznej roztworem odżywczym w określonej liczbie ampułek zamiast produktu. Po inkubacji pojemników, sterylność każdego z nich jest określana.

Większość mikroorganizmów przenoszonych drogą powietrzną jest związana z cząstkami o rozmiarze od 10 do 20 µm. Zasadniczo zmniejszenie liczby cząstek unoszących się w powietrzu wiąże się z redukcją mikroorganizmów przenoszonych powietrzem (2). Podkreśla to konieczność oprócz monitorowania mikrobiologicznego również pomiarów emisji cząstek dla pełnej oceny ryzyka. Należy określić cząstki unoszące się w powietrzu, które wydostają się z urządzenia podczas pracy z powodu zużycia i tarcia między różnymi parami materiałów. Ponieważ nie wszystkie cząstki unoszące się w powietrzu stanowią później realne zagrożenie dla produktu, dodatkowo określa się osadzone cząstki na poziomie produktu. Wizualizacja przepływu powietrza pokazuje kierunek przepływu w urządzeniu i może być również użyta do oceny ryzyka.

W niniejszym raporcie przedstawiono pełną, przykładową ocenę przydatności urządzenia do produkcji farmaceutyków sterylnych. Badane urządzenie to robot pipetujący serii Microlab Star firmy Hamilton Bonaduz AG, Szwajcaria. System był już od dwóch lat użytkowany w normalnym środowisku laboratoryjnym. Aby uzyskać wiarygodną analizę aktualnego stanu robota pipetującego, nie był on modyfikowany pod kątem późniejszej produkcji sterylnej. W zależności od wyników można przeprowadzić ewentualną celową optymalizację dla bezpiecznego użytkowania w środowiskach sterylnych.

2 Wyprowadzenie niezbędnych badań
Podstawą jest obowiązujący EU-GMP Annex 1, który jest wyraźnie wymagany do produkcji sterylnych leków. Nakłada on obowiązek podjęcia środków minimalizujących ryzyko mikrobiologicznej, cząsteczkowej i pirogennej kontaminacji (patrz rozdział „Principles” w wytycznych).

Wymagana klasa czystości powietrza musi być utrzymana podczas pracy urządzenia. Na przykład, podczas dozowania sterylnego leku w otwartym procesie, dla przestrzeni wokół procesu obowiązuje klasa ochrony GMP A, co odpowiada mniej więcej klasie czystości powietrza ISO 5 według ISO 14644-1 (3). Szczegóły znajdują się w rozdziałach 4 do 19 wytycznych EU-GMP Annex 1. --> Pomiar czystości cząstek powietrza w krytycznych punktach kontrolnych.

Klasa ochrony GMP A zazwyczaj obejmuje przepływ laminarnego powietrza z prędkością między 0,36 a 0,54 m/s. Wytyczne EU-GMP w rozdziale 3 zalecają kontrolę i walidację laminarnego przepływu powietrza podczas pracy. --> Wizualizacja przepływu.

Walidacja procesu aseptycznego zawsze obejmuje tzw. Media Fill (patrz rozdział 66 w EU-GMP Annex 1). Polega ona na zastąpieniu obsługi płynnego produktu farmaceutycznego roztworem odżywczym. Napełnione pojemniki są następnie zamykane i inkubowane. Jeśli wystąpiła kontaminacja mikrobiologiczna, roztwór będzie wykazywał wyraźne oznaki zanieczyszczenia po inkubacji. Aby wynik był wiarygodny, nie może wystąpić żaden skażony pojemnik spośród 5000. Jeśli choć jeden jest skażony, konieczne jest powtórzenie całej symulacji Media Fill po udanej analizie błędów (patrz rozdział 69 w EU-GMP Annex 1). --> Symulacja Media Fill.

Różne podręczniki farmaceutyczne określają limity dla cząstek cząsteczkowych w parenteraliach sterylnych (4) (5). Ryzyko takiego zanieczyszczenia cząsteczkami określa się poprzez pomiar osadów cząstek na silikonowych waflach w miejscu obsługi produktu. --> Ryzyko kontaminacji cząsteczkowej. Mierzy się liczbę i rozkład wielkości osadzonych cząstek na poziomie produktu. Ta sama metoda jest stosowana na płytkach osadzeniowych Plate Count Agar PCA do określenia --> mikrobiologicznego ryzyka kontaminacji.

Poniżej szczegółowo opisano poszczególne badania. System został wprowadzony do pomieszczenia czystego klasy ISO 1 według ISO 14644-1 w instytucie Fraunhofer IPA po uprzednim oczyszczeniu (3). Usunięto dach robota pipetującego, tworząc w ten sposób system RABS (Restricted Access Barrier System), jak w Rysunku 1. Dostęp do poziomu produktu był możliwy tylko przez otwarty dostęp pod pokrywą. Pokrywa może być otwarta do celów serwisowych, ale podczas normalnej pracy pozostaje zamknięta.

3 Przeprowadzone badania
3.1 Pomiar czystości cząstek powietrza w krytycznych punktach kontrolnych
Jako krytyczne punkty kontrolne wybrano punkty bezpośrednio pod ramieniem robota (MP01 do MP03). Punkt pomiarowy (MP04) rejestrował wywiew powietrza, który wydostawał się spod zamkniętej podczas pomiaru pokrywy serwisowej. Pomiar i analiza zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi VDI 2083 Blatt 9.1 (6). Użyto czterech liczników cząstek LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, USA. Do pomiaru zastosowano reprezentatywną metodę napełniania, mieszania i dozowania cieczy w płytkach wielokomorowych.

Wszystkie punkty pomiarowe osiągnęły z bezpieczeństwem statystycznym 99,9% klasę czystości powietrza ISO 4 według ISO 14644-1. Tym samym spełniają wymagania EU-GMP Annex 1 dotyczące czystości cząstek w otoczeniu podczas otwartych procesów sterylnych.

3.2 Wizualizacja przepływu
Do wizualizacji przepływu używa się generatora mgły z czystej wody. Generuje on drobną, wyraźnie widoczną mgłę, która po kondensacji na powierzchniach odparowuje bez pozostawiania śladów. Na podstawie różnych nagrań filmowych z trwającego procesu pipetowania wykazano, że główny kierunek przepływu powietrza od filtra w przestrzeni czystej przez urządzenie na bok i w dół był konsekwentny. Nie stwierdzono obszarów zastoju ani przepływów przeciwnych głównemu kierunkowi. Gdy kanały pipetujące w Microlab Star miały wystarczającą odległość od siebie, powietrze mogło swobodnie krążyć między kanałami. Wizualizacja przepływu pokazała również, że cząstki generowane przez poszczególne kanały są zwykle usuwane przez przepływ powietrza z urządzenia i nie osiadają na powierzchni produktu.

3.3 Symulacja Media Fill
Do przeprowadzenia symulacji Media Fill wprowadzono do sterylnych pojemników roztwór odżywczy, który następnie był napełniany metodą reprezentatywną pipetowania do sterylnych 96-dołkowych płyt wielokomorowych i mieszany z innym roztworem odżywczym. Po ostatecznym dozowaniu do płyt zamknięto je sterylnymi pokrywami, wyjęto z pomieszczenia czystego i inkubowano zgodnie z wytycznymi. Po inkubacji sprawdzano każdą komorę. Jeśli pojawiła się mętność, wskazywało to na mikrobiologiczną kontaminację. Po badaniu 5376 dołków nie stwierdzono żadnej widocznej mętności. Nawet po przedłużonej inkubacji nie zaobserwowano wzrostu bakterii ani grzybów. Oznacza to, że badany robot pipetujący może skutecznie przejść test Media Fill zgodnie z EU-GMP Annex 1, pod warunkiem pracy w pomieszczeniu czystym klasy GMP A lub ISO 5 lub lepszym. Szczególnie istotne jest, że przed symulacją Media Fill system nie był sterylizowany parą wodną lub formaliną, a jedynie powierzchnie zostały odkażone 70% izopropanolem, co można uznać za „najgorszy scenariusz”. Sterylizacja gazowa w późniejszym procesie aseptycznym dezaktywuje potencjalną mikrobiologiczną kontaminację na powierzchniach, pozostawiając jedynie możliwe do wykrycia pyrogenne cząstki.

3.4 Pomiar ryzyka kontaminacji na poziomie produktu
Rzeczywista kontaminacja cząsteczkowa lub mikrobiologiczna pojawia się dopiero wtedy, gdy cząstki lub mikroorganizmy osadzą się w fiolce, ampułce lub dołku przez sedymentację lub impakt. Aby symulować takie zanieczyszczenie, przeprowadzono pomiary na poziomie produktu.

3.4.1 Ryzyko kontaminacji mikrobiologicznej
Do symulacji ryzyka mikrobiologicznej kontaminacji na poziomie produktu użyto na krytycznych pozycjach na powierzchni osadzeniowych PCA (Sterile Plate Count-Agar PCA plates o średnicy 55 mm). Proces pipetowania powtórzono cztery razy, co odpowiadało około dwugodzinnej ekspozycji płytek PCA. Dłuższa ekspozycja nie jest zalecana ze względu na możliwe wysychanie płytek. Po inkubacji płytek PCA oceniono je wizualnie pod kątem widocznych kolonii. Nie wykryto żadnych kolonii na żadnej z płytek. Kontrola pozytywna w normalnym środowisku laboratoryjnym potwierdziła zdolność PCA do hodowli mikroorganizmów unoszących się w powietrzu. W ten sposób nie wykryto ryzyka mikrobiologicznej kontaminacji przez osadzone lub impaktowane mikroorganizmy na poziomie produktu podczas czterech cykli. Wynik ten potwierdza wyniki testu Media Fill.

3.4.2 Ryzyko kontaminacji cząsteczkowej
Do symulacji ryzyka cząsteczkowego na poziomie produktu użyto silikonowych wafli o średnicy 100 mm. Dlaczego wafle silikonowe? Ze względu na ich idealnie gładką powierzchnię istnieją w pełni zautomatyzowane systemy pomiarowe, które w krótkim czasie mogą określić liczbę, koncentrację i rozkład wielkości osadzonych lub impaktowanych cząstek. W instytucie Fraunhofer IPA użyto do tego urządzenia Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, USA). Wszystkie pomiary przeprowadzono w pomieszczeniu czystym klasy ISO 1. Po ustaleniu niezbędnych cykli obsługi do pomiaru wykonano dwa cykle pomiarowe. Czyszczono powierzchnię wafli przed i po określonej liczbie cykli obsługi. Wyniki pomiarów przeliczono na powierzchnię pojedynczego dołka w płytce 96-dołkowej. Dla pojedynczego cząstki o rozmiarze od 0,21 do 7,7 µm prawdopodobieństwo zanieczyszczenia wynosi 0,05% na dołek. Dla cząstki od 1,4 do 63 µm prawdopodobieństwo wynosi 0,04% na dołek.

Co oznacza ta wartość w odniesieniu do ustalonych limitów? Dla cząstek > 10 µm, Europejska Farmakopea w rozdziale 2.9.19 określa dopuszczalny limit 6000 cząstek (5). Prawdopodobieństwo, że podczas 30-minutowego procesu pipetowania do tego samego otwartego dołka trafią dwie cząstki w rozmiarze od 1,4 do 63 µm, jest większe niż jedna na milion! W związku z tym, podczas procesu pipetowania, dołek obsługiwany przez robota, nie przekroczy statystycznie dopuszczalnego limitu 6000 cząstek > 10 µm. Oczywiście, nie uwzględniono cząstek, które już wcześniej znajdowały się w dołku jako zanieczyszczenie. Przyjęto założenie, że dołek jest idealnie czysty i znajduje się w środowisku ISO 1.

4 Podsumowanie
Wszystkie przeprowadzone badania wykazały zasadniczą przydatność robota pipetującego Hamilton Microlab Star do sterylnej produkcji parenterali. Nie stwierdzono ryzyka kontaminacji produktu w trakcie procesu.

Cząstki unoszące się w powietrzu: Jeśli środowisko czyste w pomieszczeniu docelowym spełnia wymagania EU-GMP Annex 1 i ISO 14644-1, to podczas pracy robota pipetującego Hamilton Microlab Star nie pogorszy ono swojej jakości z powodu emisji cząstek. Środowisko GMP A, jako najwyższa klasa w produkcji sterylnej, jest bez problemu utrzymywane nawet pod kanałami pipetującymi.

Kontaminacja mikrobiologiczna: Nie wykryto ryzyka mikrobiologicznego ani w symulacji Media Fill, ani w użyciu płytek PCA do osadów.

Zanieczyszczone cząstki: Prawdopodobieństwo, że otwarta fiolka lub ampułka zostanie skażona przez emitowane cząstki jest niezwykle niskie. Dopuszczalny limit określony w podręcznikach farmaceutycznych jest statystycznie nigdy nie osiągany ani nie przekraczany.

Wizualizacja przepływu: Utrzymanie laminarnych przepływów powietrza i kierunku głównego strumienia powietrza zgodnie z wymaganiami GMP A oraz zalecenie separacji personelu od otwartego produktu jest spełnione przez robota pipetującego Hamilton Microlab Star. Uzyskuje się to dzięki ścianom separującym przepływ powietrza, wlotowi powietrza przez otwarty dach obudowy oraz wylotowi powietrza z chassis pod poziomem produktu z przodu i z tyłu. Ramię robota, na którym zamocowane są kanały pipetujące, wpływa na laminarny przepływ tylko w bezpośrednim otoczeniu, ale kierunek przepływu powietrza pozostaje stały.

5 Perspektywy rozwoju
Każde środowisko produkcyjne ma własny, unikalny zakres cząstek i mikroorganizmów z charakterystycznymi problematycznymi patogenami, które są głównie zależne od warunków otoczenia i personelu. Wstępna ocena przydatności nie może symulować pełnego spektrum późniejszych zanieczyszczeń. Podkreśla to konieczność przeprowadzenia pełnego testu Media Fill zgodnie z EG-GMP Annex 1 po instalacji urządzenia w linii produkcyjnej aseptycznej, z uwzględnieniem wszystkich parametrów późniejszego użytkowania. Przedstawiona tutaj ocena nie może zastąpić takiego pełnego testu. Pokazuje jedynie metodę wstępnej oceny zasadniczej przydatności urządzenia do zastosowań aseptycznych.

6 Bibliografia

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Manufacture of sterile medicinal products. Brussels: European Commission, 2003.

2. USP 35 Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Reinräume und zugehörige Reinraumareale - Teil 1: Klassifizierung der Luftreinheit. Berlin: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Particulate Contamination: sub-visible particles. European Pharmacopeia, 7. Auflage. Straßburg: Europäisches Direktorat für Qualität von Arzneimitteln und Gesundheitswesen, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Reinraumtechnik - Reinheitstauglichkeit und Oberflächenreinheit. Berlin: Beuth Verlag, 2006.