Vizsgáztatás egy pipettázó robot steril gyártáshoz

Hamilton Microlab Star az ISO 1-es tisztatérben a Fraunhofer IPA-nál

Hamilton Microlab Star az ISO 1-es tisztatérben a Fraunhofer IPA-ban. Kép forrása: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star az ISO 1-es tisztatérben a Fraunhofer IPA-nál folyadékvizualizáció közben. Kép forrása: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star az ISO 1 tisztatérben a Fraunhofer IPA-nál egy áramlásvizualizáció során. Kép forrása: Fraunhofer IPA

Elhelyezett PCA ülemerülő lemezek a sedimentált mikroorganizmusok mérésére egy Hamilton Microlab Starban. Kép forrása: Fraunhofer IPA

Elhelyezett szilícium-waferek az üledékes részecskék mérésére egy Hamilton Microlab Star-ban. Kép forrása: Fraunhofer IPA

Tartalom:
1       Bevezetés   
2       A szükséges vizsgálatok meghatározása   
3       Elvégzett vizsgálatok   
3.1       A részecskeszám mérés kritikus ellenőrző pontokon   
3.2       Áramlás vizualizáció   
3.3       Media Fill szimuláció   
3.4       A szennyeződés kockázatának mérése a termék szintjén   
3.4.1       Mikrobiológiai szennyeződés kockázata   
3.4.2       Részecskeszámítási szennyeződés kockázata   
4       Összegzés   
5       Kilátások   
6       Irodalomjegyzék   

1     Bevezetés
Asterilizáló gyógyszerészeti termékek gyártásában alkalmazott gépek és berendezések szigorú követelményeknek kell megfelelniük. Biztosítani kell, hogy a használt berendezés soha ne jelentsen veszélyt a termékre a steril gyártás során. Egy EU-GMP Annex 1 (1) előírásai szerint működő gyógyszeripari steril termelésben a részecskeszennyezés mellett a mikrobiológiai terhelés is döntő szerepet játszik. Nyitott ampullák folyékony parenterálék töltésekor biztosítani kell, hogy a töltés közben a berendezésből ne kerüljenek részecskék vagy mikroorganizmusok az ampullába. A steril gyártás berendezésének validálásához tartozik többek között az úgynevezett „Media Fill” az EU-GMP Annex 1 szerint. Ebben például a termék helyett mikrobiológiai tápoldatot töltenek egy meghatározott számú ampullába. Az inkubálás sikeres befejezése után minden egyes tartály sterilitását ellenőrzik.

Az airborn mikroorganizmusok nagy része 10 és 20 µm közötti részecskékhez kötött. Alapvetően a levegőben lévő részecskék csökkenése a mikroorganizmusok csökkenésével jár (2). Ez hangsúlyozza a mikrobiológiai monitorozás mellett az egyéb részecskemérés szükségességét a kockázat teljes körű értékeléséhez. Fontos, hogy a berendezés működése során a kopás és súrlódás miatt keletkező levegőben lévő részecskék mennyiségét mérjük. Mivel nem minden részecske jelent valódi veszélyt a termékre, a termék szintjén szedimentált részecskéket is mérjük. Egy további áramlás vizualizáció megmutatja a berendezésben lévő légáramlást, és szintén felhasználható a kockázat értékeléséhez.

Ebben a jelentésben egy példaszerű, teljes körű alkalmassági vizsgálatot mutatunk be egy gyógyszerészeti steril gyártásra szánt berendezés esetében. A vizsgált berendezés egy Microlab Star sorozatú pipettázó robot, a Hamilton Bonaduz AG, Svájc gyártótól. A rendszer már két éve működött normál laboratóriumi környezetben a teszt időpontjában. Annak érdekében, hogy hiteles elemzést kapjunk a pipettázó robot aktuális állapotáról, a rendszert nem módosítottuk a későbbi steril gyártás céljából. Az eredményektől függően szükség szerint célzott optimalizációt lehet végrehajtani a biztonságos steril környezetben való alkalmazás érdekében.

2     A szükséges vizsgálatok meghatározása
Az alapot az aktuális EU-GMP Annex 1 adja, amely kifejezetten előírja a steril gyógyszerek gyártását. Ez előírásokat tartalmaz arra vonatkozóan, hogyan lehet minimalizálni a mikrobiális, részecske- és pyrogén szennyeződés kockázatát (lásd a „Principles” fejezetet a kézikönyvben).

A megkövetelt levegőtisztasági osztálynak működés közben is meg kell felelnie. Például, ha egy nyitott folyamatban steril gyógyszert adagolnak, akkor a dózis lépésének térségében GMP A osztály (ami kb. ISO 5 levegőtisztasági osztálynak felel meg az ISO 14644-1 szerint) az előírás. Az EU-GMP Annex 1 4-19. fejezete részletesen foglalkozik ezzel. --> A részecskeszám mérés kritikus ellenőrző pontokon.

A GMP A osztály általában lamináris légáramlást jelent 0,36–0,54 m/s sebességgel. Az EU-GMP irányelv 3. fejezetében javasolja a lamináris légáramlás ellenőrzését és validálását működés közben. --> Áramlás vizualizáció.

Az aseptikus folyamat validálásában mindig része a Media Fill, ahogy az az EU-GMP Annex 1 66. szakaszában szerepel. Ebben a folyamatban a folyékony gyógyszer helyett tápoldatot kezelnek. A töltött tartályokat lezárják, inkubálják. Mikrobiológiai szennyeződés esetén a mikroorganizmusok növekednének a tápoldatban, és az inkubáció után jól láthatóan elszíneződne. Egy érvényes eredményhez 5000 tartály esetében nem lehet egyetlen kontaminált sem. Ha csak egy is, a Media Fill-t újra kell végezni a hibák elemzése után (lásd az EU-GMP Annex 1 69. szakaszát). --> Media Fill szimuláció.

A különböző gyógyszerkönyvek határértékeket írnak elő a steril parenterálék részecskeszennyezésére (4) (5). A részecskeszámítási kockázatot azzal mérik, hogy a nyitott termékkezelés helyén szilíciumlapokra rakódott részecskéket mérnek. --> Részecskeszennyeződés kockázata. A részecskék száma és méreteloszlása mérhető a termék szintjén. Ugyanezt a módszert alkalmazzák a Plate Count Agar PCA szedimentációs lemezeken a mikrobiológiai kockázat felmérésére. --> Mikrobiológiai szennyeződés kockázata.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük az egyes vizsgálatokat. A rendszert a tisztítás után a Fraunhofer IPA ISO 1 osztályú tisztasági szobájába helyeztük be (3). A pipettázó robot tetejét eltávolítottuk, így gyakorlatilag egy RABS (Restricted Access Barrier System) jött létre, amit az 1. ábra mutat be. A termék szintjéhez való hozzáférés alapvetően csak nyitott nyíláson keresztül volt lehetséges az ajtó alatt. Az ajtó szerviz célokra nyitható, de normál működés közben zárva marad.

3     Elvégzett vizsgálatok
3.1     A részecskeszám mérés kritikus ellenőrző pontokon
Kritikus ellenőrző pontként a robotkar közvetlen alatti pontokat választottuk (MP01-től MP03-ig). Egy mérőpont (MP04) a szellőzőtér kifújását mérte, amely a mérés ideje alatt nyitott szervizajtón keresztül távozott. A méréseket és értékeléseket a VDI 2083 Blatt 9.1 irányelve szerint végeztük (6). A részecskeszámlálók négy LasAir II 110 típusú részecskeszámlálót alkalmaztak, a Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, USA. A méréshez egy reprezentatív módszert alkalmaztunk folyadékok töltésére, keverésére és adagolására többnyélű lemezekben.

Az összes mérőpont 99,9%-os statisztikai biztonsággal elérte az ISO 4 levegőtisztasági osztályt az ISO 14644-1 szerint. Ez azt jelenti, hogy minden mérőpont megfelel az EU-GMP Annex 1 levegő tisztasági követelményeinek nyitott steril folyamatok során.

3.2     Áramlás vizualizáció
A folyamat vizualizálásához tiszta víz ködgenerátort használtunk. Ez finom, jól látható ködöt generál, amely kondenzálódás esetén felszívódik, és nem hagy nyomot. Különböző felvételek készültek működés közben, amelyek megmutatták, hogy a fő áramlási irány a szűrőlemezről a berendezés oldalirányba lefelé tart, és nem keletkeznek felgyülemlési vagy ellenirányú légáramlások. Amikor a pipettázó csatornái megfelelő távolságra voltak egymástól, a légáramlás szabadon cirkulált közöttük. A vizualizációból az is kiderült, hogy a csatornákból származó részecskék a legtöbb esetben a légárammal együtt távoznak a berendezésből, és nem kerülnek a termék szintjére a felületre.

3.3     Media Fill szimuláció
A Media Fill szimulációhoz steril tápoldatot töltöttünk steril tárolóedényekbe, amelyet reprezentatív pipettázási módszerrel steril 96-kötetes műtárgyakba töltöttünk és kevertünk tápoldattal. A végső adagolás után a 96-kötetes műtárgyakat steril fedéllel lezártuk, kivittük a tisztatérből, és a felhasznált tápoldat szerint inkubáltuk. Az inkubálás után az egyes mélyedéseket vizuálisan értékeltük. Ha elszíneződést észleltünk, az mikrobiológiai szennyeződésre utal. A 5376 mélyedés vizsgálata során egyik sem mutatott látható elszíneződést az elég hosszú inkubáció után sem. Még az inkubáció meghosszabbításával sem mutatkozott baktérium- vagy gombanövekedés. Ez bizonyítja, hogy a vizsgált pipettázó robot alapvetően sikeresen elvégezte az EU-GMP Annex 1 szerint az aseptikus Media Fill-t, feltéve, hogy tisztatéri környezetben, GMP A vagy ISO 5 vagy jobb osztályban működik. Különösen, hogy a rendszer a Media Fill előtt nem sterilizálódott vízperoxid vagy formalin gázos sterilizálással, csupán a hozzáférhető felületeket tisztítószerrel, 70%-os izopropanollal fertőtlenítették, ez a Media Fill szimuláció „legrosszabb eset” szcenáriójának tekinthető. A későbbi sterilizálás gázosítással inaktiválja a felületeken esetlegesen megmaradt mikrobiális szennyeződést, és csak a potenciális pyrogén részecskeként jelentkezhet.

3.4     A szennyeződés kockázatának mérése a termék szintjén
Valódi részecske- vagy mikrobiológiai szennyeződés csak akkor fordulhat elő, ha a részecske vagy mikroorganizmus eléri a fiolát, ampullát vagy mélyedést szedimentáció vagy impaktálás révén. Ennek szimulálására később a termék szintjén mérés történt.

3.4.1     Mikrobiológiai szennyeződés kockázata
A mikrobiológiai szennyeződés szimulálására a későbbi termék szintjén szedimentációs lemezeket (Sterile Plate Count-Agar PCA lemezek, 55 mm átmérő) helyeztünk el kritikus pozíciókban. A pipettázási folyamat négy alkalommal történt, ami kb. két órás expozíciós időt jelent a PCA lemezeken. Hosszabb expozíció nem ajánlott a kiszáradás veszélye miatt. Az inkubálás után a PCA lemezeket vizuálisan értékeltük, nem mutattak látható kolóniákat. A kontroll vizsgálat normál laboratóriumi környezetben megerősítette, hogy a PCA lemezek képesek levegőben lévő mikroorganizmusok növesztésére. Így négy futás során nem mutattak mikrobiológiai szennyeződést a részecskék vagy mikroorganizmusok miatt a termék szintjén. Ez megerősíti a Media Fill eredményeit.

3.4.2     Részecskeszennyeződés kockázata
A részecskeszennyeződés szimulálására a későbbi termék szintjén 100 mm átmérőjű szilíciumlapokat helyeztünk el. Miért szilíciumlapok? Mert ezekhez teljesen automatizált mérőrendszerek léteznek, amelyek gyorsan mérik a szedimentált vagy impaktált részecskék szám- és méreteloszlását. A Fraunhofer IPA-n a Surfscan 6200 mérőeszközt használtuk (KLA Tencor AG, Milpitas, USA). Minden mérés ISO 1 osztályú tisztasági szobában történt. A sikeres méréshez szükséges kezelési ciklusokat két mérési ciklusra korlátoztuk. A részecskék számát és méreteloszlását a szilíciumlapok felületén mérjük, majd az eredményeket egy egyedi mélyedés (wells) felületére vetítjük. Egy részecske 0,21 és 7,7 µm közötti méret esetén 0,05%-os szennyezési valószínűséget mutat egyetlen wells esetében. Egy 1,4 és 63 µm közötti méretű részecske esetén ez a valószínűség 0,04%.

Mit jelent ez a számérték a megadott határértékek szempontjából? Az európai gyógyszerkönyv 2.9.19 fejezetében a 10 µm-nél nagyobb részecskék maximális száma 6000 részecske (5). Egy 30 perces pipettázási folyamat során, amikor két részecske kerül ugyanabba a nyitott mélyedésbe 1,4–63 µm között, az valószínűsége több mint egymillióból egy! Ezért egy wells a robot által generált részecskékkel statisztikailag soha nem fogja túllépni a 6000 részecskét >10 µm. Természetesen nem vettük figyelembe azokat a részecskéket, amelyek már a wells előtt jelen voltak, hanem feltételeztük, hogy egy tiszta wells és a legjobb ISO 1 tisztatéri környezet van jelen.

4     Összegzés
Minden vizsgálat bizonyította, hogy a Hamilton Microlab Star pipettázó robot alapvetően alkalmas a steril parenterálék gyártására. Nem mutattak szennyeződés kockázatot a vizsgált termékre.

Légáramló részecskék: Ha a tisztatéri környezet megfelel az EU-GMP Annex 1 és az ISO 14644-1 követelményeinek, akkor a Hamilton Microlab Star pipettázó működése nem rontja a környezet tisztaságát a részecskék kibocsátása miatt. A GMP A osztályú környezet, mint a steril gyártás legmagasabb osztálya, problémamentesen fenntartható még a pipettázó csatornái alatt is.

Mikrobiológiai szennyeződés: A Media Fill és PCA-szedimentációs lemezek alkalmazásával nem mutattak mikrobiológiai kockázatot.

Szedimentált részecskék: Az esély, hogy egy nyitott mélyedést vagy fiolát szennyez egy a berendezésből származó részecske, rendkívül alacsony. A gyógyszerkönyvek által előírt határértékek statisztikailag soha nem érhetők el vagy lépik túl ezeket.

Áramlás vizualizáció: A GMP A környezetben elvárt lamináris áramlás és a fő légáramlás irányának fenntartása, valamint a személyzet elkülönítése a nyitott terméktől a Hamilton Microlab Star pipettázó által is biztosított. Ez a berendezés a légáramlást elválasztó falak, a nyitott tető és az alatta, a termék szintje előtt és mögött elhelyezett szellőzők révén valósul meg. A robotkar, amelyhez a pipettázó csatornák rögzítve vannak, csak közvetlen környezetében befolyásolja a lamináris áramlást, de a légáramlás iránya folyamatosan megmarad.

5     Kilátások
Minden gyártási környezet sajátos részecske- és mikroorganizma-spektrumot mutat, amelyeket elsősorban a környezeti feltételek és a személyzet befolyásol. Egy előzetes alkalmassági vizsgálat nem képes szimulálni a későbbi szennyeződés spektrumát. Ezért szükséges, hogy a berendezés telepítése után teljes körű Media Fill-t végezzenek az összes későbbi paraméterrel az EG-GMP Annex 1 szerint. Ez az ismertetett alkalmassági vizsgálat csak egy módszert mutat be az alkalmasság általános értékelésére.

6     Irodalomjegyzék

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Gyártás steril gyógyszerek. Brüsszel: Európai Bizottság, 2003.

2. USP 35 Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Szabályozott helyiségek és kapcsolódó tisztatéri környezetek - 1. rész: A levegő tisztaságának osztályozása. Berlin: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Részecskeszennyeződés: láthatatlan részecskék. Európai Gyógyszerkönyv, 7. kiadás. Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Tisztatértechnika - Tisztaság és felületi tisztaság. Berlin: Beuth Verlag, 2006.