Prueba de aptitud de un robot pipeteador para la producción estéril

Hamilton Microlab Star en sala limpia ISO 1 del Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star en ISO 1 sala limpia del Fraunhofer IPA. Fuente de la imagen: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star en la sala limpia ISO 1 del Fraunhofer IPA durante una visualización de flujo. Fuente de la imagen: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star en la sala limpia ISO 1 del Fraunhofer IPA durante una visualización de flujo. Fuente de la imagen: Fraunhofer IPA

Placas de sedimentación PCA colocadas para la medición de microorganismos sedimentados en un Hamilton Microlab Star. Fuente de la imagen: Fraunhofer IPA

Sustratos de silicio colocados para la medición de partículas sedimentadas en un Hamilton Microlab Star. Fuente de la imagen: Fraunhofer IPA

Contenido:
1           Introducción   
2          Derivación de las pruebas necesarias   
3          Pruebas realizadas   
3.1       Medición de la pureza del aire en puntos críticos de control   
3.2       Visualización del flujo de aire   
3.3       Simulación de llenado con medios   
3.4       Medición del riesgo de contaminación en el nivel del producto   
3.4.1    Riesgo microbiológico de contaminación   
3.4.2    Riesgo de contaminación particulada   
4        Resumen   
5        Perspectivas   
6          Referencias bibliográficas   

1     Introducción
Las máquinas y equipos utilizados en la producción de productos farmacéuticos estériles deben cumplir con requisitos estrictos. Se debe garantizar que un equipo en uso en una producción estéril en curso no represente en ningún momento un peligro para el producto. En la producción estéril de una industria farmacéutica, que debe trabajar según las directrices del EU-GMP Anexo 1 (1), además de las contaminaciones particuladas, la carga microbiológica desempeña un papel decisivo. Cuando se llenan ampollas abiertas con parenterales líquidos, se debe garantizar que durante el proceso de llenado no ingresen partículas ni microorganismos desde la instalación en la ampolla. La validación de la instalación para una producción estéril incluye, entre otros, el llamado "Media Fill" según el EU-GMP Anexo 1. En este proceso, en lugar del producto, se llena una solución nutritiva microbiológica en un número determinado de ampollas. Luego, tras incubar con éxito los envases, se determina la esterilidad de cada uno.

La mayor parte de los microorganismos transportados por el aire están ligados a partículas entre 10 y 20 µm. En principio, una reducción de partículas en el aire implica una reducción correspondiente de microorganismos transportados por el aire (2). Esto subraya, además del monitoreo microbiológico, la necesidad de mediciones adicionales de emisión de partículas para una evaluación de riesgos completa. Es importante determinar las partículas transportadas por el aire que salen de la instalación durante la operación debido a desgastes y fricciones entre diferentes pares de materiales. Dado que no todas las partículas transportadas por el aire representan un peligro real para el producto, también se determinan partículas sedimentadas en el nivel del producto. La visualización del flujo de aire también ayuda a comprender el flujo en la instalación y puede ser utilizada para la evaluación de riesgos.

Este informe presenta una evaluación completa de la idoneidad de una instalación para la producción farmacéutica estéril. La instalación evaluada es un robot de pipeteo de la serie Microlab Star de la empresa Hamilton Bonaduz AG, Suiza. El sistema había estado en funcionamiento durante dos años en un entorno de laboratorio normal en el momento de la prueba. Para obtener un análisis representativo del estado actual del robot de pipeteo, el sistema no fue modificado para una futura producción estéril. Dependiendo de los resultados, se podrá realizar una optimización dirigida para un uso seguro en entornos de producción estéril.

2     Derivación de las pruebas necesarias
La base para esto es el actual EU-GMP Anexo 1, que es explícitamente requerido para la fabricación de medicamentos estériles. Este exige medidas para minimizar el riesgo de contaminación microbiológica, particulada y por pirógenos (ver capítulo "Principios" de la guía).

La clase de pureza del aire requerida debe mantenerse incluso durante la operación de la instalación. Por ejemplo, si en un proceso abierto se dosifica un medicamento estéril, la zona delimitada espacialmente para el paso de dosificación debe tener la clase de protección GMP A, que corresponde aproximadamente a la clase de pureza del aire ISO 5 según ISO 14644-1 (3). Esto se detalla en los apartados 4 a 19 de la guía EU-GMP Anexo 1. --> Medición de la pureza del aire en puntos críticos de control.

La clase de protección GMP A generalmente incluye un flujo de aire laminar con una velocidad entre 0,36 y 0,54 m/s. La guía EU-GMP recomienda en el capítulo 3 un control y validación del flujo laminar durante la operación en curso. --> Visualización del flujo de aire.

La validación de un proceso aséptico siempre incluye un llamado "Media Fill" (ver sección 66 en la guía EU-GMP Anexo 1). Aquí, la manipulación de un producto farmacéutico líquido se reemplaza por una solución nutritiva. Los envases llenados se cierran e incuban. Si hay contaminación microbiológica, esta crecería en el medio nutritivo y, tras un período suficiente de incubación, se volvería claramente visible. Para que la evaluación sea válida, no debe haber ningún envase contaminado en 5000 envases. Si solo uno está contaminado, se debe repetir toda la prueba de llenado con medios (ver sección 69 en la guía EU-GMP Anexo 1). --> Simulación de llenado con medios.

Los diferentes libros farmacéuticos establecen límites para la carga particulada en parenterales estériles (4) (5). La magnitud del riesgo de contaminación particulada se evalúa midiendo partículas sedimentadas en la superficie de silicio en el lugar de manipulación del producto abierto. --> Riesgo de contaminación particulada. Aquí se determina el número y distribución del tamaño de partículas sedimentadas en el nivel del producto. La misma metodología se aplica en placas de sedimentación PCA (Plate Count Agar) para determinar el --> riesgo microbiológico de contaminación.

A continuación, se describen en detalle las pruebas individuales. El sistema fue introducido en la sala limpia de clase ISO 1 según ISO 14644-1 del Fraunhofer IPA tras su limpieza. Se retiró el techo del robot de pipeteo, creando así un sistema de acceso restringido (RABS), como se muestra en la figura 1. El acceso al nivel del producto solo fue posible mediante una apertura abierta debajo de la tapa. La tapa puede abrirse para mantenimiento, pero permanece cerrada durante la operación normal.

3     Pruebas realizadas
3.1     Medición de la pureza del aire en puntos críticos de control
Se eligieron como puntos críticos de control puntos justo debajo del brazo del robot (MP01 a MP03). Un punto de medición (MP04) registró el aire de escape que sale por debajo de la tapa de servicio cerrada durante la medición. Las mediciones y evaluaciones se realizaron según la directriz VDI 2083 hoja 9.1 (6). Para la medición se utilizaron cuatro contadores de partículas LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, EE. UU. La medición se realizó mediante un método representativo de llenado, mezcla y dosificación de líquidos en placas de pocillos múltiples.

Todos los puntos de medición alcanzaron, con una seguridad estadística del 99,9 %, la clase de pureza del aire ISO 4 según ISO 14644-1. Esto cumple ampliamente con los requisitos del Anexo 1 de la guía EU-GMP respecto a la pureza particulada del aire ambiente durante procesos estériles abiertos.

3.2     Visualización del flujo de aire
Para realizar la visualización del flujo de aire se utilizó un generador de niebla de agua ultrapura. Este genera una niebla fina y muy visible que se evapora sin residuos tras la condensación en superficies. Se mostraron varias secuencias filmadas durante un proceso de pipeteo en marcha, demostrando que la dirección principal del flujo de aire, desde la cubierta del filtro en la sala limpia, se mantuvo a través del equipo hacia abajo y lateralmente. No hubo zonas de estancamiento ni corrientes de aire contrarias a la dirección principal. Cuando los canales de pipeteo del Microlab Star estaban suficientemente separados, el flujo de aire circulaba libremente entre ellos. La visualización del flujo también mostró que, en la mayoría de los casos, las partículas generadas por los canales se eliminan con el flujo de aire de la instalación y no impactan en la superficie del producto en el nivel del producto.

3.3     Simulación de llenado con medios
Para la simulación de llenado con medios, se colocó en los recipientes estériles una solución nutritiva estéril, que fue llenada en placas de 96 pocillos mediante un método de pipeteo representativo y mezclada con más solución nutritiva. Tras la dosificación final en las placas, estas se cerraron con tapas estériles, se retiraron del ambiente limpio y se incubaron según las especificaciones del medio nutritivo utilizado. Tras la incubación, se inspeccionaron las pocillos. La presencia de turbidez indicaría contaminación microbiológica. Tras examinar las 5376 pocillos procesadas, ninguna mostró turbidez visible tras una incubación prolongada. Incluso tras una incubación adicional, no se observó crecimiento de bacterias ni hongos. Esto demuestra que el robot de pipeteo evaluado puede realizar con éxito un llenado con medios en condiciones de conformidad con el Anexo 1 de EU-GMP, siempre que opere en un entorno de sala limpia GMP A o ISO 5 o mejor. Especialmente, dado que antes de la simulación de llenado con medios no se realizó esterilización con peróxido de hidrógeno o formaldehído, sino solo una desinfección superficial con alcohol isopropílico al 70%, la simulación puede considerarse un "escenario de peor caso". La esterilización posterior mediante vaporización en proceso aséptico inactiva cualquier posible contaminación microbiológica en las superficies y solo puede manifestarse como partículas pirogénicas potenciales.

3.4     Medición del riesgo de contaminación en el nivel del producto
La contaminación particulada o microbiológica real en el producto solo ocurre cuando las partículas o microorganismos llegan al vial, ampolla o pocillo por sedimentación o impacto. Para simular esta contaminación, se realizaron mediciones en el nivel del producto en etapas posteriores.

3.4.1     Riesgo microbiológico de contaminación
Para simular el riesgo microbiológico, se colocaron en el nivel del producto en las posiciones críticas placas de sedimentación (placas PCA de agar de recuento en placa, diámetro 55 mm). El proceso de pipeteo ejemplar se realizó cuatro veces, con una duración de exposición de aproximadamente dos horas. Una exposición más prolongada para aumentar la sensibilidad de detección no se recomienda debido a la posible desecación de las placas. Tras incubar todas las placas PCA, se evaluaron visualmente en busca de colonias. No se detectó ninguna colonia en ninguna placa. La prueba de control positivo en un entorno de laboratorio normal confirmó la capacidad de las placas PCA para cultivar microorganismos transportados por el aire. Por lo tanto, no se pudo detectar riesgo microbiológico de contaminación por microorganismos sedimentados o impactados en el nivel del producto durante cuatro ejecuciones. Este resultado confirma el obtenido en las pruebas de llenado con medios.

3.4.2     Riesgo de contaminación particulada
Para simular el riesgo de contaminación particulada, se colocaron en el nivel del producto obleas de silicio de 100 mm de diámetro. ¿Por qué obleas de silicio? Porque estos sustratos perfectamente lisos tienen sistemas de medición totalmente automatizados que pueden determinar en poco tiempo la concentración y distribución del tamaño de todas las partículas sedimentadas o impactadas. En el Fraunhofer IPA se utilizó el dispositivo Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, EE. UU.). Todas las mediciones se realizaron en la sala limpia de clase ISO 1. Después de definir los ciclos de manejo necesarios para una medición exitosa, se realizaron dos ciclos de medición. La carga particulada en la superficie de las obleas de silicio se midió antes y después de la cantidad definida de ciclos de manejo. Los resultados se extrapolaron a la superficie expuesta de un solo pocillo de la placa de 96 pocillos. La probabilidad de contaminación por un solo partícula en el rango de tamaño entre 0,21 y 7,7 µm fue del 0,05% por pocillo. Para partículas en el rango de 1,4 a 63 µm, la probabilidad fue del 0,04% por pocillo.

¿Qué significa este valor en relación con los límites establecidos? Para partículas > 10 µm, el libro farmacéutico europeo en el capítulo 2.9.19 establece un límite permisible de 6000 partículas (5). La probabilidad de que durante un proceso de pipeteo de 30 minutos en un pocillo abierto entren dos partículas en el rango de tamaño entre 1,4 y 63 µm es superior a una en un millón. Por lo tanto, un pocillo durante un proceso de pipeteo estadísticamente nunca superará el límite establecido de 6000 partículas > 10 µm solo por las partículas generadas por el robot. Por supuesto, no se consideran las partículas que ya estaban en el pocillo antes del proceso. Se asume un pocillo perfectamente limpio y un entorno de sala limpia ISO 1 en las mejores condiciones posibles.

4     Resumen
Todos los estudios realizados demostraron la idoneidad fundamental del robot de pipeteo Hamilton Microlab Star para la producción estéril de parenterales. No se detectó riesgo de contaminación para el producto procesado.

Partículas transportadas por el aire: Si el entorno de la sala limpia de una futura instalación cumple con los requisitos del EU-GMP Anexo 1 y ISO 14644-1, la operación del robot de pipeteo Hamilton Microlab Star no deteriorará el entorno debido a posibles emisiones de partículas. Un entorno GMP A, como la clase más alta en producción estéril, se mantiene sin problemas incluso debajo de los canales de pipeteo.

Contaminación microbiológica: No se pudo detectar ningún riesgo microbiológico en las pruebas de llenado con medios ni en las placas PCA.

Partículas sedimentadas: La probabilidad de que un pocillo abierto o un vial se contamine por partículas emitidas por la instalación es extremadamente baja. El límite establecido en los libros farmacéuticos no se alcanza ni se supera estadísticamente.

Visualización del flujo: La conservación de la laminaridad y la dirección del flujo de aire principal, requerida en entornos GMP A, y la recomendación de separar al personal del producto abierto, son cumplidas por el robot de pipeteo Hamilton Microlab Star. Esto se logra mediante paredes que aíslan el flujo de aire, la entrada de aire a través de la cubierta abierta del recinto y la salida de aire desde el chasis en la parte frontal y trasera debajo del nivel del producto. El brazo del robot, donde están fijados los canales de pipeteo de forma móvil, solo afecta la laminaridad en su entorno inmediato, manteniendo siempre la dirección del flujo de aire.

5     Perspectivas
Cada entorno de fabricación presenta un espectro individual de partículas y microorganismos con patógenos específicos, influenciados principalmente por las condiciones ambientales y el personal. Una evaluación previa de idoneidad no puede simular el espectro de contaminación que puede presentarse posteriormente. Esto subraya la necesidad de realizar un llenado con medios completo tras la instalación de una máquina en una línea de producción en condiciones asépticas, siguiendo el EU-GMP Anexo 1, con todos los parámetros utilizados posteriormente. La evaluación aquí descrita solo muestra una metodología para la evaluación básica de la idoneidad de una máquina para aplicaciones asépticas.

6     Referencias bibliográficas

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Manufacture of sterile medicinal products. Bruselas: Comisión Europea, 2003.

2. USP 35 Microbiological Evaluation of Clean Rooms and other Controlled Environments. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Áreas limpias y zonas relacionadas - Parte 1: Clasificación de la pureza del aire. Berlín: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Particulate Matter in Injections. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Contaminación por partículas: partículas subvisibles. Farmacopea Europea, 7ª edición. Estrasburgo: Dirección Europea para la Calidad de los Medicamentos y la Atención Sanitaria, 2010.

6. VDI 2083 Blatt 9.1. Tecnología de salas limpias - Pureza y limpieza de superficies. Berlín: Beuth Verlag, 2006.