Zkouška způsobilosti pipetovacího robota pro sterilní výrobu

Hamilton Microlab Star v čisté místnosti ISO 1 Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star v ISO 1 čistírně podle Fraunhofer IPA. Obrázek: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star v ISO 1 čistírně vzduchu Fraunhofer IPA během vizualizace proudění. Zdroj obrázku: Fraunhofer IPA

Hamilton Microlab Star v ISO 1 čistírně prostor Fraunhofer IPA během vizualizace proudění. Zdroj obrázku: Fraunhofer IPA

Rozložené PCA sedimentační desky pro měření sedimentovaných mikroorganismů v Hamilton Microlab Star. Zdroj obrázku: Fraunhofer IPA

Rozložené křemíkové wafery pro měření sedimentovaných částic v Hamilton Microlab Star. Zdroj obrázku: Fraunhofer IPA

Obsah:
1       Úvod   
2       Odvození nutných zkoušek   
3       Prováděné zkoušky   
3.1       Měření částicové čistoty vzduchu na kritických kontrolních místech   
3.2       Vizualizace proudění vzduchu   
3.3       Simulace Media Fill   
3.4       Měření rizika kontaminace na úrovni produktu   
3.4.1    Mikrobiologické riziko kontaminace   
3.4.2    Částicové riziko kontaminace   
4       Shrnutí   
5       Výhled   
6       Literatura   

1    Úvod
Stroje a zařízení používané při výrobě sterilních farmaceutik musí splňovat přísné požadavky. Je nutné zajistit, že žádný používaný zařízení během běžící sterilní výroby nepředstavuje hrozbu pro produkt. Ve sterilní výrobě farmaceutického průmyslu, která musí pracovat podle požadavků EU-GMP Annex 1 (1), hraje vedle částicové kontaminace klíčovou roli mikrobiologické zatížení. Při plnění otevřených ampulí s tekutými parenterálními přípravky musí být zajištěno, že během plnění se z zařízení do ampule nedostanou částice ani mikroorganismy. Validace zařízení pro sterilní výrobu zahrnuje mimo jiné takzvaný „Media Fill“ podle EU-GMP Annex 1. Při něm je namísto produktu do určitých ampulí naplněna mikrobiologická živná tekutina. Po úspěšném inkubování je určena sterilita každé jednotlivé nádoby.

Velká část mikroorganismů přenášených vzduchem je vázána na částice o velikosti mezi 10 a 20 µm. Obecně platí, že snížení počtu částic ve vzduchu je spojeno s odpovídajícím snížením mikroorganismů přenášených vzduchem (2). To podtrhuje vedle mikrobiologického monitoringu nutnost dalších měření emisí částic pro úplné hodnocení rizika. Je třeba určit částice přenášené vzduchem, které unikají ze zařízení během provozu kvůli opotřebení a tření mezi různými materiály. Protože ne všechny částice přenášené vzduchem představují skutečné nebezpečí pro produkt, jsou dále určovány sedimentované částice na úrovni produktu. Vizualizace proudění vzduchu ukazuje proudění vzduchu v zařízení a může být rovněž využita pro hodnocení rizika.

Tento zpráva představuje kompletní exemplární posouzení způsobilosti zařízení pro výrobu sterilních farmaceutik. Testované zařízení je pipetovací robot série Microlab Star od firmy Hamilton Bonaduz AG, Švýcarsko. Systém byl při testování již dva roky provozován v běžném laboratorním prostředí. Aby byla získána relevantní analýza současného stavu robota, nebyl systém upraven pro pozdější sterilní výrobu. V závislosti na jednotlivých výsledcích může být provedena cílená optimalizace pro bezpečné použití v sterilních výrobních prostředích.

2    Odvození nutných zkoušek
Základem je aktuální EU-GMP Annex 1, který je explicitně požadován pro výrobu sterilních léčiv. Vyžaduje opatření ke snížení rizika mikrobiální, částicové a pyrogenní kontaminace (viz kapitola „Principy“ v příručce).

Požadovaná třída čistoty vzduchu musí být zachována i během provozu zařízení. Například při dávkování sterilního léku v otevřeném procesu platí pro prostorově omezené prostředí dávkovacího kroku ochranná třída GMP A, což odpovídá přibližně třídě čistoty ISO 5 podle ISO 14644-1 (3). Podrobnosti jsou uvedeny v oddílech 4 až 19 příručky EU-GMP Annex 1. --> Měření částicové čistoty vzduchu kritických kontrolních bodů.

Ochranná třída GMP A obvykle zahrnuje laminární proudění vzduchu s rychlostí mezi 0,36 a 0,54 m/s. EU-GMP doporučuje v kapitole 3 kontrolu a validaci laminárního proudění během provozu. --> Vizualizace proudění vzduchu.

Validace aseptického procesu vždy zahrnuje tzv. Media Fill (viz oddíl 66 v EU-GMP Annex 1). Při ní je manipulace s tekutým farmaceutickým produktem nahrazena živnou tekutinou. Naplněné nádoby jsou poté uzavřeny a inkubovány. Pokud došlo k mikrobiální kontaminaci, poroste v živném médiu a po dostatečné inkubaci bude zřetelně zakalené. Aby byla zajištěna platná závěrečná hodnocení, nesmí být u 5000 nádob žádná kontaminovaná. Pokud je pouze jedno kontaminované, musí být celý Media Fill opakován po úspěšné analýze chyb (viz oddíl 69 v EU-GMP Annex 1). --> Simulace Media Fill.

Různé farmaceutické knihy stanovují limity pro možnou částicovou zátěž sterilních parenterálů (4) (5). Úroveň rizika takové částicové zátěže je určována měřením sedimentovaných částic na silikonových waferech na místě otevřeného manipulace s produktem. --> Částicové riziko kontaminace. Měří se počet a velikostní rozdělení sedimentovaných částic na úrovni produktu. Stejná metoda je použita na sedimentačních deskách Plate Count Agar PCA k určení --> mikrobiologického rizika kontaminace.

Následující text podrobně popisuje jednotlivé zkoušky. Systém byl po vyčištění zaveden do čistého prostoru třídy ISO 1 podle ISO 14644-1 Fraunhofer IPA. Odstraněním krytu pipetovacího robota vzniklo jakési RABS (Restricted Access Barrier System), jak je vidět na obrázku 1. Přístup do úrovně produktu byl možný pouze otevřeným zásahovým místem pod krytem. Kryt může být otevřen pro servis, ale v běžném provozu zůstává zavřený.

3    Prováděné zkoušky
3.1    Měření částicové čistoty vzduchu kritických kontrolních bodů
Jako kritická kontrolní místa byly zvoleny body přímo pod ramenem robota (MP01 až MP03). Měřicí bod (MP04) zachycoval odvod vzduchu, který vychází pod zavřeným servisním krytem během měření. Měření a vyhodnocení byla provedena podle směrnice VDI 2083 list 9.1 (6). Použity byly čtyři čítače částic LasAir II 110, Particle Measuring Systems, Inc., Boulder, USA. Měření bylo provedeno reprezentativní metodou plnění, míchání a dávkování tekutin do multi-víčkových destiček.

Všechny měřicí body dosáhly s 99,9% statistickou jistotou třídy čistoty vzduchu ISO 4 podle ISO 14644-1. Tím splňují všechny požadavky příručky EU-GMP Annex 1 na částicovou čistotu okolního vzduchu během otevřených sterilních procesů.

3.2    Vizualizace proudění vzduchu
Pro vizualizaci proudění vzduchu je použit generátor mlhy čisté vody. Ten vytváří jemnou, dobře viditelnou mlhu, která při případné kondenzaci na površích znovu bez zbytku odpaří. Během natáčení různých záběrů při běžícím procesu pipetování bylo ukázáno, že primární směr proudění od filtračního krytu čistého prostoru je vždy dodržován i kolem zařízení směrem dolů na stranu. Neexistovaly žádné oblasti zadržené vody nebo protichůdné proudění vzduchu. Jakmile měly jednotlivé kanály pipetování dostatečnou vzdálenost, mohl vzduch volně cirkulovat i mezi kanály. Vizualizace proudění ukázala také, že částice generované jednotlivými kanály jsou většinou odstraňovány prouděním vzduchu ze zařízení a nedochází k jejich impaktu na povrch produktu.

3.3    Simulace Media Fill
Pro simulaci Media Fill byla do sterilních zásobníků vložena sterilní živná tekutina, která byla pomocí reprezentativní pipetovací metody naplněna sterilními 96 jamkovými destičkami a smíchána s další živnou tekutinou. Po finálním dávkování do 96 jamkových destiček byly uzavřeny sterilním víkem, vyjmuty ze sterilního prostoru a inkubovány podle požadavků použitého živného média. Po inkubaci byly jednotlivé jamky vyhodnoceny na přítomnost viditelných kolonií. Pokud byla patrná zakalení, znamenalo to mikrobiální kontaminaci. Vyhodnocením všech 5376 jamek nebyla u žádné z nich zjištěna žádná patrná zakalení po dostatečné době inkubace. I po prodloužené inkubaci se neobjevilo žádné růst bakterií nebo plísní. Tím bylo prokázáno, že zkoumaný pipetovací robot může úspěšně absolvovat sterilní Media Fill podle EU-GMP Annex 1, pokud je umístěn v čistém prostoru třídy GMP A nebo ISO 5 či lepší. Zejména vzhledem k tomu, že před provedením simulace Media Fill nebyl systém sterilizován pomocí vodíkového peroxidu nebo formaldehydu, ale pouze byly povrchy čištěny jednoduchou desinfekcí otřením 70% izopropanolem, lze tuto simulaci považovat za „nejhorší scénář“. Sterilizace pomocí plynů v následném aseptickém procesu inaktivuje případnou mikrobiologickou kontaminaci na površích a zůstává pouze jako možný pyrogenní částice.

3.4    Měření rizika kontaminace na úrovni produktu
Skutečná částicová nebo mikrobiologická kontaminace produktu nastává až tehdy, když částice nebo mikroorganismy dosáhnou do lahvičky, ampule nebo jamky sedimentací nebo impakcí. Aby bylo možné tuto kontaminaci simulovat, byly později provedeny měření na úrovni produktu.

3.4.1    Mikrobiologické riziko kontaminace
Pro simulaci mikrobiologického rizika kontaminace byly na kritických místech na úrovni produktu umístěny sedimentační desky (sterilní desky Plate Count Agar PCA s průměrem 55 mm). Reprezentativní pipetovací proces byl proveden čtyřikrát, což odpovídá expozici PCA desek přibližně dvě hodiny. Delší expozice by mohla zvýšit citlivost detekce, ale není doporučována kvůli možnému vyschnutí desek. Po inkubaci všech PCA desek byly vizuálně vyhodnoceny na přítomnost kolonií. U žádné desky nebyla žádná kolonie zjištěna. Kontrola v běžném laboratorním prostředí potvrdila schopnost PCA desek kultivovat vzduchem přenášené mikroorganismy. Tím nebylo zjištěno žádné mikrobiologické riziko kontaminace sedimentovanými nebo impaktovanými mikroorganismy na úrovni produktu během čtyř opakovaných testů. Tato zkouška potvrzuje výsledek Media Fill testů.

3.4.2    Částicové riziko kontaminace
Pro simulaci částicového rizika kontaminace byly na úrovni produktu použity silikonové wafery o průměru 100 mm. Proč silikonové wafery? Protože pro tyto dokonale hladké substráty existují plně automatizované měřicí systémy, které dokážou rychle určit početní koncentraci a velikostní rozdělení sedimentovaných nebo impaktovaných částic. Na Fraunhofer IPA byl použit měřicí přístroj Surfscan 6200 (KLA Tencor AG, Milpitas, USA). Všechny měření byla provedena v čistém prostoru třídy ISO 1. Po stanovení potřebných cyklů manipulace pro úspěšné měření byly provedeny dvě měřicí cykly. Při nich byla měřena částicová zátěž povrchů silikonových waferů před a po definovaném počtu manipulací. Výsledky měření byly převedeny na plochu jednoho jamkového místa v 96 jamkové destičce. Pravděpodobnost kontaminace jedním částicím o velikosti mezi 0,21 a 7,7 µm je 0,05 % na jamku. U částic o velikosti mezi 1,4 a 63 µm je pravděpodobnost kontaminace 0,04 % na jamku.

Co znamenají tyto hodnoty v souvislosti s definovanými limity? Pro částice větší než 10 µm stanovuje Evropská farmakopeje v kapitole 2.9.19 povolený limit 6000 částic (5). Pravděpodobnost, že během 30minutového pipetovacího procesu do stejné otevřené jamky proniknou dvě částice o velikosti mezi 1,4 a 63 µm, je více než jedna ku milionu! Tím pádem během pipetovacího procesu nikdy nebude jamka obsahovat více než 6000 částic větších než 10 µm, což je limit stanovený. Samozřejmě, že nebyly zohledněny částice, které se již předem nacházejí v jamce jako kontaminace. Předpokládá se ideálně čistá jamka a nejlepší možné prostředí čistého prostoru třídy ISO 1.

4    Shrnutí
Všechny provedené zkoušky ukázaly základní způsobilost zkoušeného pipetovacího robota Hamilton Microlab Star pro sterilní výrobu parenterálů. Nebyly zjištěny žádné riziko kontaminace zpracovaného produktu.

Vzdušné částice: Pokud prostředí čistého prostoru odpovídá požadavkům EU-GMP Annex 1 a ISO 14644-1, nebude během provozu pipetovacího robota Hamilton Microlab Star prostředí čistého prostoru zhoršováno kvůli možnému emisím částic. Nejvyšší třída GMP A v sterilní výrobě je bez problémů dodržována i pod pipetovacími kanály.

Mikrobiologická kontaminace: V rámci provedeného Media Fill ani při použití PCA sedimentačních desek nebylo riziko mikrobiologické kontaminace prokázáno.

Sedimentované částice: Pravděpodobnost, že otevřená jamka nebo lahvička bude kontaminována částicemi emitovanými zařízením, je velmi nízká. Limit stanovený farmakopeemi je tímto statisticky nikdy dosažen nebo překročen.

Vizualizace proudění vzduchu: Udržování laminárního proudění a směru primárního proudění vzduchu v prostředí GMP A a doporučení separace personálu od otevřeného produktu jsou splněny robotem Hamilton Microlab Star. To je zajištěno stěnami oddělujícími proudění vzduchu, vstupem vzduchu přes otevřenou střechu krytu a výstupem vzduchu z rámu pod úrovní produktu vpředu i vzadu. Ruka robota, na níž jsou pohyblivě připojeny pipetovací kanály, ovlivňuje laminární proudění pouze v bezprostřední blízkosti, přesto je směr proudění vzduchu trvale zachován.

5    Výhled
Každé výrobní prostředí má svůj individuální spektrum částic a mikroorganismů s konkrétními problémovými mikroby, které jsou ovlivněny především okolními podmínkami a personálem. Předběžné posouzení způsobilosti tedy nemůže simulovat pozdější spektrum kontaminace. To zdůrazňuje požadavek, že po instalaci zařízení v aseptické výrobní lince musí být provedeno úplné Media Fill podle EG-GMP Annex 1 s použitím všech později používaných parametrů. Tato předběžná posouzení nelze považovat za úplnou náhradu. Ukazuje pouze metodiku základního posouzení způsobilosti zařízení pro aseptické aplikace.

6    Literatura

1. EU-GMP Guide to Good Manufacturing Practice, Annex 1. Výroba sterilních léčiv. Brusel: Evropská komise, 2003.

2. USP 35 Mikrobiologické hodnocení čistých prostor a jiných kontrolovaných prostředí. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2012.

3. DIN EN ISO 14644-1. Čisté prostory a s nimi související oblasti - Část 1: Třídění čistoty vzduchu. Berlín: Beuth Verlag, 1999.

4. USP Částice v injekcích. The United States Pharmacopeia. Rockville MD: United States Pharmacopeial Convention, 2011.

5. Ph. Eur. 2.9.19: Částicová kontaminace: neviditelné částice. Evropská farmakopeje, 7. vydání. Štrasburk: Evropská agentura pro kvalitu léčiv a zdravotní péči, 2010.

6. VDI 2083 List 9.1. Čisté prostory - Čistota a povrchová čistota. Berlín: Beuth Verlag, 2006.