Rapide également dans la plage nanométrique – Percée en microscopie à fluorescence à haute résolution

Mesure du moteur protéique Kinesine-1 (rouge), tel qu'il « marche » sur les microtubules (blanc). La observation des mouvements en 2D de dimères individuels de Kinesine-1 (colorés dans la esquisse) sous des concentrations physiologiques d'ATP montre comment ils progressent le long de voies individuelles. MINFLUX capture jusqu'à présent des détails inédits du mouvement de la protéine motrice sur des protofilaments individuels du microtubule (dessiné en gris) et souligne ainsi le potentiel de MINFLUX comme méthode révolutionnaire pour observer les changements de conformation dans les protéines. (Image : MPI pour la recherche médicale) / Mesure détaillée de la façon dont la protéine motrice kinesine-1 (rouge) marche sur les microtubules (blanc). Le suivi des mouvements en 2D de dimères individuels de kinesine-1 (codés par couleur sur la esquisse) à des concentrations physiologiques d'ATP a révélé des détails clés sur la façon dont la protéine marche dans des voies individuelles. MINFLUX a permis un suivi proche des protofilaments de la protéine motrice sur le microtubule (dessiné en gris) et met en évidence l'efficacité de MINFLUX en tant qu'outil pour surveiller les changements de conformation dans les protéines. (Photo : MPI pour la recherche médicale)

Les scientifiques* autour du prix Nobel Stefan Hell de l'Institut Max Planck de recherche médicale à Heidelberg ont développé un microscope super-résolution avec une précision spatiale-temporelle d’un nanomètre par milliseconde. Il s’agit d’une version améliorée de la microscopie MINFLUX récemment introduite par le groupe de Hell. Le microscope à haute résolution permet d’observer en détail de minuscules mouvements de protéines individuelles comme jamais auparavant. Dans cette étude, ils ont examiné le mouvement étape par étape de la protéine motrice Kinesine-1, qui se déplace le long des microtubules à travers la cellule. Les résultats soulignent le potentiel de MINFLUX comme un nouvel outil révolutionnaire pour l’observation des changements de conformation des protéines dans un rayon de nanomètres. Le travail a été récemment publié dans Science.

Pour déchiffrer les événements à l’intérieur d’une cellule, nous devons comprendre la biochimie de chaque protéine. La mesure des plus petites modifications de position et de forme constitue l’un des plus grands défis. La microscopie par fluorescence, en particulier la microscopie à super-résolution (c’est-à-dire la nanoscopie), est devenue indispensable dans cette recherche. MINFLUX, l’une des techniques de nanospectroscopie par fluorescence les plus récentes, a déjà atteint une résolution spatiale d’un à quelques nanomètres : la taille de petites molécules organiques. Mais pour faire progresser notre compréhension de la physiologie cellulaire moléculaire, des observations avec une résolution spatiale-temporelle encore plus élevée sont nécessaires.

Maximiser la puissance de MINFLUX

Lorsque le groupe de Stefan Hell a présenté MINFLUX pour la première fois en 2016, il était déjà possible de suivre des protéines marquées par fluorescence dans des cellules. Cependant, le mouvement des protéines était aléatoire, et la précision des mesures se situait dans une gamme de dix nanomètres. L’étude publiée cette semaine dans Science est la première à appliquer la capacité de résolution spatio-temporelle inégalée de MINFLUX aux changements de conformation des protéines, en particulier de la protéine motrice Kinesine-1. Pour cela, les chercheurs du MPI de Heidelberg ont développé une nouvelle version de MINFLUX pour observer en mouvement des molécules fluorescentes individuelles.

Les méthodes précédemment utilisées pour mesurer la dynamique des protéines sont fortement limitées dans leur capacité à capter la zone critique (sous-)nanométrique / (sous-)milliseconde. Certaines offrent une haute résolution spatiale allant jusqu’à quelques nanomètres, mais ne peuvent pas suivre les changements assez rapidement. D’autres ont une haute résolution temporelle, mais nécessitent un marquage avec des billes réfléchissantes (perles) en or, germanium ou latex, qui sont deux à trois ordres de grandeur plus grosses que la protéine à étudier. Cela peut influencer fortement la fonction de la protéine, empêchant d’observer la véritable activité protéique. En revanche, avec MINFLUX, il suffit de lier une molécule de fluorescence classique d’environ 1 nanomètre à la protéine. Ainsi, MINFLUX peut atteindre une haute résolution tout en perturbant presque pas la fonction de la protéine. Cela est indispensable pour étudier le mouvement des protéines natives. « Un microscope MINFLUX isolé du bruit ambiant, travaillant près de la limite théorique, est un défi », explique Otto Wolff, doctorant dans le groupe. « Et réaliser des expériences de manière à ne pas influencer la fonction de la protéine tout en montrant le mécanisme biologique, c’est une autre étape », ajoute son collègue Lukas Scheiderer.

Le microscope MINFLUX présenté par le groupe peut enregistrer les mouvements de protéines avec une précision spatiale-temporelle allant jusqu’à 1,7 nanomètres par milliseconde. Pour cela, il ne nécessite que la détection d’environ 20 photons émis par la molécule fluorescente.

« Je suis convaincu que nous sommes en train d’ouvrir un nouveau chapitre dans l’étude des mouvements et des changements de forme de molécules protéiques », déclare Stefan Hell. « La combinaison d’une haute résolution spatiale et temporelle que propose MINFLUX permettra aux chercheurs d’étudier les biomolécules comme jamais auparavant. »

Résolution du mouvement étape par étape de Kinesine-1 avec ATP dans des conditions physiologiques

Kinesine-1 joue un rôle clé dans le transport de la cargaison à travers nos cellules, et des mutations de cette protéine sont à l’origine de plusieurs maladies. Kinesine-1 « marche » le long de filaments (les microtubules) qui traversent nos cellules comme un réseau de routes. On peut littéralement imaginer ce mouvement comme une « étape », car la protéine possède deux « pattes », appelées « têtes » dans la littérature spécialisée, qui changent alternativement de position sur les microtubules. Ce déplacement se produit généralement le long d’un des 13 protofilaments qui composent le microtubule. La progression de ces « têtes » est alimentée par la coupure de l’ATP (adénosine triphosphate), la principale source d’énergie de la cellule.

Les chercheurs ont marqué Kinesine-1 avec une seule molécule de fluorescence, enregistrant ainsi les étapes régulières d’environ 16 nanomètres de chaque « tête », ainsi que les sous-étapes de ce processus de marche, qui n’avaient pas encore été observées. La résolution spatiale-temporelle était de l’ordre du nanomètre par milliseconde. Leurs résultats montrent que l’ATP est absorbé lorsque seule une « tête » est liée au microtubule. En revanche, l’hydrolyse de l’ATP se produit lorsque les deux « têtes » sont liées. Il a été observé que le « bâton » du protéine tourne lors d’une étape. C’est la partie du molécule de kinesine qui maintient la cargaison. Grâce à la haute résolution spatiale et temporelle de MINFLUX, une rotation de la tête lors du début de chaque étape a également été visible. Les mesures ont été effectuées avec des concentrations physiologiques d’ATP, ce qui n’avait pas été possible auparavant.

Potentiel futur dans l’étude des mouvements protéiques

« Je suis curieux de voir où MINFLUX nous mènera encore. Il ajoute une nouvelle dimension à l’étude du fonctionnement des protéines. Cela peut nous aider à comprendre les mécanismes moléculaires derrière de nombreuses maladies et contribuer finalement au développement de thérapies », ajoute Jessica Matthias, ancienne post-doctorante dans l’équipe de Stefan Hell, qui explore désormais l’application de MINFLUX à une multitude de questions biologiques dans une start-up du Max Planck Institute.