Rychle i v nanometrovém rozsahu – průlom v vysoce rozlišující fluorescenční mikroskopii

Měření motorového proteinu kinesin-1 (červená), jak „kráčí“ po mikrotubulech (bílá). Sledování 2D pohybů jednotlivých dimérů kinesinu-1 (na nákresu barevně odlišeno) při fyziologických koncentracích ATP odhalilo klíčové detaily toho, jak protein putuje jednotlivými pruhy. MINFLUX umožnil sledování téměř po protofilamentu motorového proteinu na mikrotubulu (nakresleno šedě) a zdůrazňuje účinnost MINFLUX jako nástroje pro sledování konformačních změn v proteinech. (Fotografie: MPI pro lékařský výzkum)

Vědci*ky kolem nositele Nobelovy ceny Stephana Hella z Max-Planck-Institutu pro lékařský výzkum v Heidelbergu vyvinuli superrozlišující mikroskop s prostorově-časovou přesností jednoho nanometru za milisekundu. Jedná se o vylepšenou verzi nedávno zavedené MINFLUX mikroskopie skupiny kolem Hella. Vysoce rozlišující mikroskop umožňuje detailnější sledování malých pohybů jednotlivých proteinů než kdy předtím. V této studii zkoumali krokový pohyb motorového proteinu Kinesin-1, jak se pohybuje podél mikrotubulů uvnitř buňky. Výsledky zdůrazňují potenciál MINFLUX jako revolučního nového nástroje pro pozorování konformačních změn v proteinech v nanometrovém rozsahu. Tato práce byla nedávno publikována v časopise Science.

Pro odhalení dění uvnitř buňky musíme pochopit biochemii jednotlivých proteinů. Měření nejmenších změn polohy a tvaru je jednou z největších výzev. Fluorescenční mikroskopie, zejména superrozlišující mikroskopie (tj. nanoskopie), se stala při tomto výzkumu nepostradatelnou. MINFLUX, jeden z nejnovějších metod fluorescenční nanoskopie, již dosáhl prostorového rozlišení od jednoho do několika nanometrů: velikosti menších organických molekul. Ale pro posun našeho porozumění molekulární buněčné fyziologii jsou nutná pozorování s ještě vyšším prostorově-časovým rozlišením.

Maximalizace výkonu MINFLUX

Když skupina kolem Stephana Hella představila MINFLUX poprvé v roce 2016, již bylo možné sledovat fluorescenčně označené proteiny uvnitř buněk. Pohyb proteinů však byl náhodný a přesnost měření se pohybovala v řádu deseti nanometrů. Studie publikovaná tento týden v časopise Science je první, která využívá dosud nedosažitelné prostorově-časové rozlišení MINFLUX na konformační změny proteinů, zejména motorového proteinu Kinesin-1. K tomu vědci z Heidelberského MPI pro lékařský výzkum vyvinuli novou verzi MINFLUX, která umožňuje sledovat jednotlivé fluorescenční molekuly v pohybu.

Dosud používané metody měření dynamiky proteinů jsou silně omezené ve své schopnosti zachytit rozhodující (sub)nanometrové / (sub)milisekundové oblasti. Některé nabízejí vysoké prostorové rozlišení až do několika nanometrů, ale nedokážou změny sledovat dostatečně rychle. Jiné mají vysoké časové rozlišení, ale vyžadují označení pomocí světelně rozptylujících kuliček (korálků) z zlata, germánia nebo latexu, které jsou dvě až tři řády větší než samotný protein. To může funkci proteinu tak výrazně ovlivnit, že není možné s jistotou pozorovat skutečnou proteinnou funkci. Naopak u MINFLUX stačí, aby na protein bylo navázáno běžné fluorescenční molekula o velikosti cca 1 nanometru. Tak může MINFLUX dosáhnout vysokého rozlišení, aniž by příliš narušil funkci proteinu. To je nezbytné pro studium pohybu přirozených proteinů. „Minimálně stíněný MINFLUX mikroskop, který pracuje blízko teoretické hranice, je jednou z výzev,“ říká Otto Wolff, doktorand ve skupině. „A provádět experimenty tak, aby neovlivnily funkci proteinu a zároveň ukázaly biologický mechanismus, je druhou výzvou,“ doplňuje jeho kolega Lukas Scheiderer.

Nově představený MINFLUX mikroskop skupiny dokáže zaznamenávat pohyby proteinů s prostorově-časovou přesností až 1,7 nanometru za milisekundu. K tomu mikroskop potřebuje detekovat pouze asi 20 fotonů emitovaných fluorescenční molekulou.

„Jsem přesvědčen, že tím otevíráme novou kapitolu ve studiu pohybů a tvarových změn jednotlivých proteinových molekul,“ říká Stefan Hell. „Kombinace vysokého prostorového a časového rozlišení, kterou MINFLUX nabízí, umožní vědcům zkoumat biomolekuly tak, jak to dříve nebylo možné.“

Rozlišení krokového pohybu Kinesinu-1 s ATP za fyziologických podmínek

Kinesin-1 hraje klíčovou roli při transportu nákladu uvnitř našich buněk a mutace tohoto proteinu jsou příčinou několika nemocí. Kinesin-1 „kroká“ po filamentech (mikrotubulech), které proplétají naše buňky jako síť silnic. Pohyb si lze doslova představit jako „krok“, protože protein má dvě „nohy“, které se v odborné literatuře nazývají „hlavy“, jež střídavě mění svou pozici na mikrotubulech. Tento pohyb se obvykle odehrává podél jednoho z 13 protofilamentů, které tvoří mikrotubuly. Postup těchto „hlav“ je poháněn štěpením hlavního energetického zdroje buňky ATP (adenosin trifosfát).

Vědci označili Kinesin-1 pouze jednou fluorescenční molekulou a zaznamenali tak pravidelné kroky o velikosti asi 16 nanometrů jednotlivých hlav, stejně jako mezikroky tohoto procesu, které dosud nebyly pozorovány. Přitom prostorově-časové rozlišení bylo v oblasti nanometrů za milisekundu. Jejich výsledky ukazují, že ATP je přijímáno, když je pouze jedna hlava proteinu vázána na mikrotubulus. Naopak hydrolyza ATP probíhá, když jsou obě hlavy vázány. Bylo pozorováno, že se „stvol“ proteinu při jednom kroku otáčí. To je část Kinesinového molekuly, která drží náklad. Díky vysokému prostorovému a časovému rozlišení MINFLUX bylo také možné sledovat rotaci hlavy v počáteční fázi každého kroku. Měření byla provedena za fyziologických koncentrací ATP, což dříve nebylo možné.

Budoucí potenciál ve výzkumu pohybů proteinů

„Těším se, kam nás MINFLUX ještě zavede. Přidává další rozměr do výzkumu funkce proteinů. To nám může pomoci pochopit molekulární mechanismy za mnoha chorobami a nakonec přispět k vývoji terapií,“ dodává Jessica Matthias, bývalá postdoktorandka ve skupině Stephana Hella, která nyní v jedné z výzkumných skupin Max-Planckova institutu zkoumá využití MINFLUX na řadu biologických otázek.