Gyorsan a nanométeres tartományban is – áttörés a nagy felbontású fluoreszcens mikroszkópiában

Mérés a motorfehérje Kinesin-1 (piros) "járásáról" a mikrotubulusokon (fehér). Az egyedi Kinesin-1-dimerek 2D mozgásának nyomon követése (különböző színekkel a vázlaton) fiziológiai ATP-koncentrációk mellett feltárja, hogyan haladnak egyes pályákon. A MINFLUX eddig észrevétlen részleteket rögzített a motorfehérje mozgásáról a mikrotubulus egyes protofilamentjein (szürke színnel vázolva), ezáltal hangsúlyozva a MINFLUX potenciálját mint forradalmi módszert a fehérjék konformációs változásainak megfigyelésében. (Kép: MPI az Orvostudományi Kutatásért) / Részletes mérés arról, hogyan "jár" a motorfehérje kinesin-1 (piros) a mikrotubulusokon (fehér). Az egyedi kinesin-1 dimerek 2D mozgásának nyomon követése (színkódolt a vázlaton) fiziológiai ATP-koncentrációk mellett feltárta, hogyan haladnak a fehérjék egyes pályákon. A MINFLUX lehetővé tette a motorfehérje közel protofilament szintű nyomon követését a mikrotubuluson (szürke színnel vázolva), és hangsúlyozza a MINFLUX hatékonyságát mint eszközt a fehérjék konformációs változásainak monitorozására. (Fotó: MPI az Orvostudományi Kutatásért)

Tudósok Stefan Hell Nobel-díjas kutatóval az Max-Planck-Institut für medizinische Forschung Heidelbergben egy szuperfelbontó mikroszkópot fejlesztettek ki, amely egy nanométeres térbeli-Időbeli pontossággal rendelkezik egy milliszekundum alatt. Ez egy továbbfejlesztett változata a Hell csoport által nemrég bemutatott MINFLUX mikroszkópiának. A nagyfelbontású mikroszkóp lehetővé teszi, hogy részletesebben figyeljük meg az egyes fehérjék apró mozgásait, mint valaha. Ebben a tanulmányban vizsgálták a Kinesin-1 motorfehérje lépésmozgását, ahogy a mikrotubulusokon halad át a sejtben. Az eredmények hangsúlyozzák a MINFLUX potenciálját, mint forradalmi új eszközt a konformációváltozások nanométeres tartományban történő megfigyelésében fehérjékben. A munka nemrég jelent meg a Science folyóiratban.

Ahhoz, hogy megértsük a sejten belüli eseményeket, meg kell értenünk az egyes fehérjék biokémiáját. Ennek során a legkisebb hely- és alakváltozások mérésének az egyik legnagyobb kihívásnak számít. A fluoreszcens mikroszkópia, különösen a szuperfelbontó mikroszkópia (azaz nanoszkópia), elengedhetetlen ebben a kutatásban. A MINFLUX, az egyik legújabb fluoreszcens nanoszkópia módszer, már elérte a térbeli felbontást egy-két nanométernél: az apró szerves molekulák méretében. Azonban a molekuláris sejtfiziológia jobb megértéséhez még magasabb térbeli-Időbeli felbontású megfigyelésekre van szükség.

A MINFLUX képességének maximalizálása

Amikor Stefan Hell csoportja 2016-ban bemutatta a MINFLUX-ot, már lehetővé tette fluoreszcens címkézett fehérjék követését a sejtekben. Azonban a fehérjék mozgása véletlenszerű volt, és a mérési pontosság tíz nanométeres nagyságrendű volt. A héten a Science-ban megjelent tanulmány az első, amely alkalmazza a MINFLUX eddig el nem ért tér- és időbeli felbontóképességét a fehérjék konformációváltozásainak, különösen a Kinesin-1 motorfehérjének vizsgálatára. Ennek érdekében a Heidelbergi MPI für medizinische Forschung kutatói kifejlesztettek egy új MINFLUX-verziót, amely lehetővé teszi az egyes fluoreszcens molekulák mozgás közbeni megfigyelését.

A korábban használt módszerek a fehérjemozgások mérésére erősen korlátozottak abban, hogy a döntő (szub-)nanométeres / (szub-)milliszekundumos tartományt megragadják. Néhány magas térbeli felbontást kínál, akár néhány nanométeren belül, de nem képesek elég gyorsan követni a változásokat. Mások magas időbeli felbontással rendelkeznek, de fényvisszaverő golyókkal (gyöngyökkel) való címkézést igényelnek, amelyek két-három nagyságrenddel nagyobbek, mint a vizsgált fehérje. Ez a fehérje funkcióját olyan mértékben befolyásolhatja, hogy nem lehet biztosan megfigyelni a valódi fehérje működését. A MINFLUX esetében azonban csak egy hagyományos fluoreszcens molekula kötése szükséges a fehérjéhez, amely kb. 1 nanométeres méretű. Így a MINFLUX eléri a magas felbontást, miközben szinte nem zavarja a fehérje működését. Ez elengedhetetlen a natív fehérjék mozgásának vizsgálatához. „Egy környezetből származó zajtól védett MINFLUX mikroszkóp, amely közelít a elméleti határhoz, az egyik kihívás” - mondja Otto Wolff, a csoport PhD-hallgatója. „És az, hogy ezeket a kísérleteket úgy végezzük, hogy ne befolyásolják a fehérje működését, miközben meg tudjuk mutatni a biológiai mechanizmust, egy másik” - egészíti ki kollégája, Lukas Scheiderer.

A csoport által most bemutatott MINFLUX mikroszkóp képes fehérjemozgásokat rögzíteni akár 1,7 nanométeres térbeli-Időbeli pontossággal milliszekundumonként. Ehhez a mikroszkóp mindössze kb. 20 fluoreszcens molekula által kibocsátott fotont kell észlelnie.

„Biztos vagyok benne, hogy egy új fejezetet nyitunk a fehérjemozgások és alakváltozások kutatásában” - mondja Stefan Hell. „A magas térbeli és időbeli felbontás kombinációja, amit a MINFLUX kínál, lehetővé teszi a tudósok számára, hogy olyan biomolekulákat vizsgáljanak, mint soha korábban.”

A Kinesin-1 lépésmozgásának felbontása ATP-vel fiziológiai körülmények között

A Kinesin-1 kulcsszerepet játszik a sejtek közötti szállításban, és a fehérje mutációi több betegség okai. A Kinesin-1 „lépdel” a filamentumokon (mikrotubulusokon), amelyek hálózatként szövik át a sejteket. A mozgást szó szerint „lépésnek” lehet nevezni, mivel a fehérjének két „láb”-a, amiket szakirodalmi nevükön „fejek”-nek hívnak, váltakozva váltják pozíciójukat a mikrotubulusokon. Ez a mozgás általában az egyik 13 protofilamentum mentén történik, amelyek a mikrotubulusokat alkotják. Ennek a „lábnak” a haladása a sejt fő energiaszállítójának, az ATP (adenozin-trifoszfát) bontásával történik.

A kutatók egyetlen fluoreszcens molekulával jelölték meg a Kinesin-1-et, így rögzítették az egyes „lábak” körülbelül 16 nanométeres lépéseit, valamint a lépés során végbemenő al-lépéseket, amelyeket eddig nem lehetett megfigyelni. A térbeli-Időbeli felbontás nanométeres per milliszekundumos tartományban volt. Eredményeik azt mutatják, hogy az ATP felvétele akkor történik, amikor csak egy láb kötött a mikrotubulushoz. Ezzel szemben az ATP-hidrolízis akkor zajlik, amikor mindkét láb kötött. Megfigyelték, hogy a fehérje „rúdja” forgást végez a lépés során. Ez az a rész, amely a szállítmányt tartja. A MINFLUX magas térbeli és időbeli felbontásának köszönhetően láthatóvá vált a fej forgása a lépés kezdeti szakaszában is. A méréseket fiziológiai ATP-koncentráció mellett végezték, ami eddig nem volt lehetséges.

Jövőbeli lehetőségek a fehérjemozgások kutatásában

„Kíváncsian várom, hová vezet minket a MINFLUX. Egy új dimenziót ad a fehérjék működésének kutatásához. Ez segíthet megérteni a molekuláris mechanizmusokat számos betegség hátterében, és végső soron terápiák kifejlesztésében is hozzájárulhat” - mondja Jessica Matthias, Stefan Hell egykori posztdoktori kutatója, aki most a Max Planck Intézet egyik startupjában a MINFLUX alkalmazását kutatja számos biológiai kérdésben.