Snel ook op nanometerschaal – doorbraak in de hoogwaardig fluorescentiemicroscopie

Meting van het motor-eiwit kinesine-1 (rood), zoals het "loopt" op de microtubuli (wit). Het volgen van de 2D-bewegingen van individuele kinesine-1-dimeren (in verschillende kleuren op de schets) onder fysiologische ATP-concentraties onthult belangrijke details over hoe het eiwit zich voortbeweegt op afzonderlijke banen. MINFLUX registreert daarbij tot nu toe onerkende details van de beweging van het motor-eiwit op individuele protofilamenten van de microtubulus (grijs geschetst) en benadrukt zo het potentieel van MINFLUX als revolutionaire methode voor het observeren van conformatieveranderingen in eiwitten. (Afbeelding: MPI voor Medisch Onderzoek) / Gedetailleerde meting van hoe het motor-eiwit kinesine-1 (rood) op microtubuli (wit) loopt. Het volgen van de 2D-bewegingen van individuele kinesine-1-dimeren (kleurgecodeerd op de schets) bij fysiologische ATP-concentraties onthulde belangrijke details over hoe het eiwit zich in afzonderlijke banen voortbeweegt. MINFLUX maakte bijna protofilament-tracking van het motor-eiwit op de microtubulus mogelijk (geschetst in grijs) en onderstreept de effectiviteit van MINFLUX als een hulpmiddel voor het monitoren van conformatieveranderingen in eiwitten. (Foto: MPI voor Medisch Onderzoek)

Wetenschappers* om Nobelprijswinnaar Stefan Hell aan het Max-Planck-Institut voor medische onderzoek in Heidelberg hebben een superresolutiemicroscoop ontwikkeld met een ruimtelijk-tijdelijke precisie van één nanometer per milliseconde. Het is een verbeterde versie van de onlangs door de groep rond Hell geïntroduceerde MINFLUX-microscopie. De hoogresolutieve microscoop maakt het mogelijk om kleine bewegingen van individuele eiwitten gedetailleerder te observeren dan ooit tevoren. In deze studie onderzochten ze de stapbeweging van het motor-eiwit Kinesine-1, zoals het langs microtubuli door de cel wandelt. De resultaten onderstrepen het potentieel van MINFLUX als revolutionair nieuw instrument voor het observeren van conformatieveranderingen in eiwitten in het nanometerbereik. Het werk werd onlangs gepubliceerd in Science.

Om de gebeurtenissen binnen een cel te ontrafelen, moeten we de biochemie van individuele eiwitten begrijpen. Daarbij is het meten van kleinste positie- en vormveranderingen een van de grootste uitdagingen. Fluorescentiemicroscopie, met name superresolutieve microscopie (d.w.z. nanoscopie), is onmisbaar geworden bij dit onderzoek. MINFLUX, een van de jongste methoden voor fluorescentie-nanoscopie, heeft al een ruimtelijke resolutie van één tot enkele nanometers bereikt: de grootte van kleinere organische moleculen. Maar om ons begrip van de moleculaire cellulaire fysiologie te bevorderen, zijn observaties met nog hogere ruimtelijke-tijdelijke resolutie vereist.

De prestaties van MINFLUX maximaliseren

Toen de groep rond Stefan Hell in 2016 voor het eerst MINFLUX presenteerde, kon men hiermee al met fluorescerende gemerkte eiwitten in cellen volgen. De beweging van de eiwitten was echter willekeurig, en de nauwkeurigheid van de metingen lag op ongeveer tien nanometer. De studie die deze week in Science werd gepubliceerd, is de eerste die de tot nu toe onbereikbare ruimtelijk-tijdelijke resolutie van MINFLUX toepast op conformatieveranderingen van eiwitten, met name het motor-eiwit Kinesine-1. Hiervoor ontwikkelden de wetenschappers aan het Heidelbergse MPI voor medische onderzoek een nieuwe MINFLUX-versie om individuele fluorescerende moleculen in beweging te observeren.

Tot nu toe gebruikte methoden voor het meten van eiwitdynamiek zijn sterk beperkt in hun vermogen om de cruciale (sub-)nanometer- / (sub-)milliseconden-gebieden te vastleggen. Sommige bieden een hoge ruimtelijke resolutie van tot enkele nanometers, maar kunnen veranderingen niet snel genoeg volgen. Andere hebben een hoge temporele resolutie, maar vereisen een markering met lichtverstrooiende bolletjes (beads) van goud, germanium of latex, die twee tot drie ordes groter zijn dan het te bestuderen eiwit zelf. Hierdoor wordt de functie van het eiwit onder omstandigheden zo sterk beïnvloed dat men niet zeker kan zijn dat men de werkelijke eiwitfunctie observeert. Voor MINFLUX daarentegen hoeft slechts een gewoon fluorescerend molecuul met een grootte van ongeveer 1 nanometer aan het eiwit te worden gebonden. Zo kan MINFLUX de hoge resolutie bereiken terwijl het de eiwitfunctie zo min mogelijk stoort. Dit is essentieel voor het onderzoek naar de beweging van native eiwitten. "Een door ruis uit de omgeving afgeschermd MINFLUX-microscoop, dat dicht bij de theoretische grens werkt, is één uitdaging," zegt Otto Wolff, promovendus in de groep. "En de experimenten zo uitvoeren dat ze de eiwitfunctie niet beïnvloeden en toch de biologische mechanismen kunnen tonen, is een tweede," voegt zijn collega Lukas Scheiderer toe.

De door de groep gepresenteerde MINFLUX-microscoop kan eiwitbewegingen vastleggen met een ruimtelijk-tijdelijke precisie van tot 1,7 nanometer per milliseconde. Hiervoor hoeft het microscoop slechts ongeveer 20 door het fluorescerende molecuul uitgezonden fotonen te detecteren.

"Ik ben ervan overtuigd dat we hiermee een nieuw hoofdstuk aan het openen zijn, namelijk in het onderzoek naar de bewegingen en vormveranderingen van individuele eiwitmoleculen," zegt Stefan Hell. "De combinatie van hoge ruimtelijke en temporele resolutie die MINFLUX biedt, zal wetenschappers in staat stellen biomoleculen te bestuderen zoals dat voorheen niet mogelijk was."

Resolutie van de stapbeweging van Kinesine-1 met ATP onder fysiologische omstandigheden

Kinesine-1 speelt een sleutelrol bij het transport van ladingen door onze cellen, en mutaties in het eiwit zijn de oorzaak van verschillende ziekten. Kinesine-1 "stapt" langs filamenten (de microtubuli) die onze cellen als een netwerk van wegen doorkruisen. Men kan de beweging letterlijk voorstellen als een "stap", omdat het eiwit twee "voeten", die in de vakliteratuur ook wel "koppen" worden genoemd, afwisselend hun positie op de microtubuli veranderen. Deze beweging gebeurt normaal gesproken langs een van de 13 protofilamenten die de microtubuli vormen. Het vooruitgaan van deze "koppen" wordt aangedreven door de splitsing van de belangrijkste energieleverancier van de cel, ATP (adenosinetrifosfaat).

De wetenschappers markeerden Kinesine-1 met slechts één fluorescerend molecuul en registreerden zo de reguliere ca. 16 nanometer brede stappen van de individuele koppen, evenals onderstappen van dit loopproces die tot nu toe niet konden worden waargenomen. Daarbij lag de ruimtelijk-tijdelijke resolutie in het nanometer-gebied per milliseconde. Hun resultaten tonen aan dat ATP wordt opgenomen terwijl slechts één kop aan de microtubuli gebonden is. Daarentegen vindt de ATP-hydrolyse plaats terwijl beide koppen gebonden zijn. Er werd waargenomen dat de "steel" van het eiwit zich tijdens een stap draait. Dit is het deel van het kinesine-molecuul dat de lading vasthoudt. Door de hoge ruimtelijke en temporele resolutie van MINFLUX werd ook een rotatie van de kop in de beginfase van elke stap zichtbaar. De metingen werden gedaan bij fysiologische ATP-concentraties, wat tot nu toe niet mogelijk was.

Toekomstig potentieel in het onderzoek naar eiwitbewegingen

"Ik ben benieuwd waar MINFLUX ons nog naartoe zal leiden. Het voegt een nieuwe dimensie toe aan het onderzoek naar de werking van eiwitten. Dit kan ons helpen de moleculaire mechanismen achter veel ziekten te begrijpen en uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van therapieën," voegt Jessica Matthias toe, een voormalige postdoctoraal onderzoeker in Stefan Hell’s groep, die nu in een spin-off van het Max-Planck-Institut de toepassing van MINFLUX op een breed scala aan biologische vraagstukken onderzoekt.