Rápido incluso en el rango de nanómetros – Avance en la microscopía de fluorescencia de alta resolución

Medición del motor proteico Kinesina-1 (rojo), cómo "camina" sobre los microtúbulos (blanco). La observación de los movimientos en 2D de los dímeros individuales de Kinesina-1 (codificados por colores en el esquema) bajo concentraciones fisiológicas de ATP revela detalles clave de cómo el proteína avanza en carriles individuales. MINFLUX permite rastrear cerca de los protofilamentos del motor proteico en el microtúbulo (esquematizado en gris) y destaca la eficacia de MINFLUX como una herramienta para monitorear cambios conformacionales en proteínas. (Foto: MPI para la investigación médica)

Los científicos y científicas dirigidos por el Premio Nobel Stefan Hell en el Instituto Max Planck de Investigación Médica en Heidelberg han desarrollado un microscopio superresolvente con una precisión espacio-temporal de un nanómetro por milisegundo. Es una versión mejorada de la microscopía MINFLUX, recientemente introducida por el grupo de Hell. Este microscopio de alta resolución permite observar con más detalle los movimientos diminutos de proteínas individuales que nunca antes. En este estudio, investigaron el movimiento paso a paso de la proteína motora Kinesina-1, mientras avanza a lo largo de los microtúbulos dentro de la célula. Los resultados subrayan el potencial de MINFLUX como una herramienta revolucionaria para observar cambios de conformación en proteínas en el rango nanométrico. El trabajo fue publicado recientemente en Science.

Para entender los procesos dentro de una célula, debemos comprender la bioquímica de proteínas individuales. Entre los mayores desafíos está la medición de los más pequeños cambios en posición y forma. La microscopía de fluorescencia, especialmente la microscopía superresolvente (es decir, la nanoscopía), se ha vuelto indispensable en esta investigación. MINFLUX, uno de los métodos más recientes de nanoscopía por fluorescencia, ya ha alcanzado una resolución espacial de uno a unos pocos nanómetros: el tamaño de moléculas orgánicas pequeñas. Pero para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología celular molecular, se requieren observaciones con una resolución espacio-temporal aún mayor.

Maximizar la capacidad de MINFLUX

Cuando el grupo de Stefan Hell presentó MINFLUX por primera vez en 2016, ya permitía rastrear proteínas marcadas con fluorescencia en las células. Sin embargo, el movimiento de las proteínas era aleatorio y la precisión de las mediciones estaba en el orden de diez nanómetros. El estudio publicado esta semana en Science es el primero en aplicar la capacidad de resolución espacio-temporal sin precedentes de MINFLUX a cambios de conformación en proteínas, en particular en la proteína motora Kinesina-1. Para ello, los científicos del MPI de Heidelberg desarrollaron una nueva versión de MINFLUX para observar moléculas fluorescentes individuales en movimiento.

Los métodos utilizados hasta ahora para medir la dinámica de proteínas están muy limitados en su capacidad para captar cambios en el rango (sub-)nanométrico / (sub-)milisegundo. Algunos ofrecen una alta resolución espacial de hasta unos pocos nanómetros, pero no pueden seguir los cambios lo suficientemente rápido. Otros tienen una alta resolución temporal, pero requieren una marcación con pequeñas bolas de luz (perlas) de oro, germanio o látex, que son de dos a tres órdenes de magnitud más grandes que la propia proteína en estudio. Esto puede afectar tan significativamente la función de la proteína que no se puede estar seguro de observar su función real. En cambio, para MINFLUX basta con que una molécula de fluorescencia convencional, de aproximadamente 1 nanómetro de tamaño, esté unida a la proteína. De esta forma, MINFLUX puede alcanzar una alta resolución sin perturbar casi la función de la proteína. Esto es imprescindible para estudiar el movimiento de proteínas nativas. "Un microscopio MINFLUX aislado del ruido ambiental, que opere cerca del límite teórico, es un desafío", dice Otto Wolff, estudiante de doctorado en el grupo. "Y realizar experimentos que no afecten la función de la proteína y, al mismo tiempo, puedan mostrar el mecanismo biológico, es otro", añade su colega Lukas Scheiderer.

El microscopio MINFLUX presentado por el grupo ahora puede registrar movimientos de proteínas con una precisión espacio-temporal de hasta 1,7 nanómetros por milisegundo. Para ello, el microscopio solo necesita detectar aproximadamente 20 fotones emitidos por la molécula fluorescente.

"Estoy seguro de que estamos abriendo un nuevo capítulo en la investigación de los movimientos y cambios de forma de moléculas proteicas individuales", dice Stefan Hell. "La combinación de alta resolución espacial y temporal que ofrece MINFLUX permitirá a los científicos estudiar biomoléculas de formas que antes no eran posibles."

Resolución del movimiento paso a paso de Kinesina-1 con ATP en condiciones fisiológicas

Kinesina-1 desempeña un papel clave en el transporte de cargas dentro de nuestras células, y mutaciones en esta proteína son la causa de varias enfermedades. Kinesina-1 "camina" a lo largo de filamentos (los microtúbulos) que atraviesan nuestras células como una red de calles. La movimiento puede imaginarse literalmente como un "paso", ya que la proteína tiene dos "pies", que en la literatura especializada llaman "cabezas", que alternan su posición en los microtúbulos. Este movimiento generalmente ocurre a lo largo de uno de los 13 protofilamentos que componen el microtúbulo. La marcha de estas "cabezas" es impulsada por la escisión del principal proveedor de energía de la célula, el ATP (adenosín trifosfato).

Los científicos marcaron Kinesina-1 con solo una molécula de fluorescencia, y registraron así los pasos regulares de unos 16 nanómetros de las cabezas individuales, así como los subpasos de este proceso de marcha, que hasta ahora no se habían podido observar. La resolución espacio-temporal alcanzó el rango de nanómetros por milisegundo. Sus resultados muestran que el ATP se ingiere mientras solo una cabeza está unida a los microtúbulos. En cambio, la hidrólisis del ATP ocurre cuando ambas cabezas están unidas. Se observó que la "astilla" del extremo del protein, que sostiene la carga, gira durante un paso. Esto corresponde a la parte del molécula de kinesina que transporta la carga. Gracias a la alta resolución espacial y temporal de MINFLUX, también fue posible visualizar una rotación de la cabeza en la fase inicial de cada paso. Las mediciones se realizaron con concentraciones fisiológicas de ATP, algo que antes no era posible.

Potencial futuro en la investigación del movimiento de proteínas

"Estoy ansioso por ver a dónde nos llevará MINFLUX en el futuro. Añade una dimensión más a la investigación del funcionamiento de las proteínas. Esto puede ayudarnos a entender los mecanismos moleculares detrás de muchas enfermedades y, en última instancia, contribuir al desarrollo de terapias", añade Jessica Matthias, ex postdoctoranda en el grupo de Stefan Hell, que ahora investiga en una spin-off del Instituto Max Planck la aplicación de MINFLUX a una variedad de cuestiones biológicas.