Rapido anche nel campo dei nanometri – Svolta nella microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione

Misurazione del motore proteico Kinesin-1 (rosso), come "cammina" lungo i microtubuli (bianco). Il monitoraggio dei movimenti 2D di singoli dimeri di kinesin-1 (colorati nella figura) a concentrazioni fisiologiche di ATP rivela dettagli chiave di come il proteina si muove lungo singoli binari. MINFLUX ha permesso di tracciare quasi in prossimità dei protofilamenti il motore proteico sul microtubulo (raffigurato in grigio) e mette in evidenza l'efficacia di MINFLUX come strumento per monitorare i cambiamenti conformazionali nelle proteine. (Foto: MPI per la Ricerca Medica)

Scienziat*e intorno al premio Nobel Stefan Hell presso l'Istituto Max Planck per la Ricerca Medica a Heidelberg hanno sviluppato un microscopio super-risolutivo con una precisione spaziale-temporale di un nanometro al millisecondo. È una versione migliorata della recente microscopia MINFLUX introdotta dal gruppo di Hell. Il microscopio ad alta risoluzione permette di osservare in modo più dettagliato i minuscoli movimenti di singole proteine rispetto a prima. In questo studio hanno esaminato il movimento a passi della proteina motrice Kinesina-1, mentre si sposta lungo i microtubuli all’interno della cella. I risultati evidenziano il potenziale di MINFLUX come strumento rivoluzionario per l’osservazione delle variazioni conformazionali delle proteine nel range nanometrico. Il lavoro è stato recentemente pubblicato su Science.

Per decifrare gli eventi all’interno di una cella, dobbiamo comprendere la biochimica delle singole proteine. La misurazione delle più piccole variazioni di posizione e forma rappresenta una delle maggiori sfide. La microscopia a fluorescenza, in particolare la microscopia super-risolutiva (cioè la nanoscopia), è diventata indispensabile in questa ricerca. MINFLUX, uno dei più recenti metodi di nanoscopia a fluorescenza, ha già raggiunto una risoluzione spaziale di uno o pochi nanometri: la dimensione di molecole organiche molto piccole. Tuttavia, per avanzare nella nostra comprensione della fisiologia cellulare molecolare, sono necessarie osservazioni con una risoluzione spaziale-temporale ancora superiore.

Massimizzare le capacità di MINFLUX

Quando il gruppo di Stefan Hell ha presentato per la prima volta MINFLUX nel 2016, era già possibile tracciare proteine marcate con fluorescenza all’interno delle cellule. Tuttavia, il movimento delle proteine era casuale e la precisione delle misurazioni si attestava su un ordine di grandezza di dieci nanometri. Lo studio pubblicato questa settimana su Science rappresenta il primo ad applicare la capacità di risoluzione spazio-temporale finora ineguagliata di MINFLUX alle variazioni conformazionali delle proteine, in particolare della proteina motrice Kinesina-1. A tal fine, i ricercatori dell’MPI di Heidelberg per la Ricerca Medica hanno sviluppato una nuova versione di MINFLUX per osservare in movimento singole molecole fluorescenti.

Le metodologie finora utilizzate per misurare le dinamiche proteiche sono fortemente limitate nella loro capacità di catturare l’intervallo decisivo (sub-)nanometrico / (sub-)millisecondo. Alcune offrono un’alta risoluzione spaziale fino a pochi nanometri, ma non riescono a seguire i cambiamenti abbastanza rapidamente. Altre hanno un’alta risoluzione temporale, ma richiedono un marcatore con sfere di luce riflettente (perline) di oro, germanio o lattice, che sono due o tre ordini di grandezza più grandi della proteina stessa. Ciò può influenzare così tanto la funzione della proteina da rendere difficile osservare la sua reale attività. Per MINFLUX, invece, basta legare al protein un normale molecola di fluorescenza di circa 1 nanometro di dimensione. In questo modo, MINFLUX può raggiungere un’alta risoluzione senza disturbare significativamente la funzione proteica. Questo è essenziale per lo studio del movimento di proteine native. "Un microscopio MINFLUX schermato dal rumore ambientale, che lavora vicino al limite teorico, è una delle sfide", afferma Otto Wolff, dottorando nel gruppo. "E condurre esperimenti in modo che non influenzino la funzione proteica e allo stesso tempo possano mostrare il meccanismo biologico è un’altra", aggiunge il suo collega Lukas Scheiderer.

Il microscopio MINFLUX presentato dal gruppo può registrare i movimenti delle proteine con una precisione spazio-temporale fino a 1,7 nanometri al millisecondo. Per farlo, il microscopio necessita di rilevare solo circa 20 fotoni emessi dalla molecola fluorescente.

"Sono sicuro che stiamo aprendo un nuovo capitolo, quello nello studio dei movimenti e delle variazioni di forma di singole molecole proteiche", afferma Stefan Hell. "La combinazione di alta risoluzione spaziale e temporale offerta da MINFLUX permetterà agli scienziati di studiare i biomolecole come mai prima d’ora."

Risoluzione del movimento a passi di Kinesina-1 con ATP in condizioni fisiologiche

Kinesina-1 svolge un ruolo chiave nel trasporto di carichi all’interno delle nostre cellule, e mutazioni di questa proteina sono alla base di diverse malattie. La Kinesina-1 "cammina" lungo filamenti (i microtubuli) che attraversano le nostre cellule come una rete di strade. Si può immaginare il movimento come un "passo", dato che la proteina ha due "piedi", chiamati in letteratura "teste", che alternano la loro posizione sui microtubuli. Questo movimento avviene normalmente lungo uno dei 13 protofilamenti che costituiscono i microtubuli. La progressione di queste "teste" è alimentata dalla scissione del principale fornitore di energia della cellula, l’ATP (adenosin trifosfato).

Gli scienziati hanno marcato la Kinesina-1 con un singolo molecola di fluorescenza, e hanno così registrato i regolari passi di circa 16 nanometri di ciascuna delle "teste", così come le sotto-fasi di questo processo di camminata, che finora non erano state osservate. La risoluzione spazio-temporale raggiunta era nell’ordine di nanometri al millisecondo. I loro risultati mostrano che l’ATP viene assorbito mentre solo una delle due "teste" è legata ai microtubuli. Al contrario, l’idrolisi dell’ATP avviene quando entrambe le "teste" sono legate. È stato osservato che durante un passo, il "gambo" della proteina ruota. Questa è la parte del complesso di Kinesina che tiene il carico. Grazie all’alta risoluzione spaziale e temporale di MINFLUX, è stata anche visibile una rotazione della testa all’inizio di ogni passo. Le misurazioni sono state effettuate con concentrazioni fisiologiche di ATP, cosa finora impossibile.

Potenziale futuro nello studio dei movimenti proteici

"Sono curioso di scoprire dove ci porterà ancora MINFLUX. Aggiunge una nuova dimensione allo studio delle funzioni delle proteine. Questo può aiutarci a comprendere i meccanismi molecolari alla base di molte malattie e contribuire allo sviluppo di terapie", conclude Jessica Matthias, ex postdoc nel gruppo di Stefan Hell, che ora, in una spin-off dell’Istituto Max Planck, studia l’applicazione di MINFLUX a una vasta gamma di questioni biologiche.