Szybko również w zakresie nanometrów – przełom w wysokorozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej

Pomiar motorowego białka kinesin-1 (czerwony), jak "porusza się" po mikrotubulach (biały). Obserwacja ruchów 2D pojedynczych dimery kinesinu-1 (na szkicu w różnych kolorach) przy fizjologicznych stężeniach ATP pokazuje, jak poruszają się one wzdłuż pojedynczych ścieżek. MINFLUX umożliwił dotąd wykrycie nieznanych szczegółów ruchu tego białka na pojedynczych protofilamentach mikrotubulu (narysowanych na szaro) i podkreśla potencjał MINFLUX jako rewolucyjnej metody do obserwacji zmian konformacyjnych w białkach. (Obraz: MPI dla badań medycznych) / Szczegółowy pomiar tego, jak motorowe białko kinesin-1 (czerwony) porusza się po mikrotubulach (biały). Śledzenie ruchów 2D pojedynczych dimery kinesinu-1 (kodowanych kolorami na szkicu) przy stężeniach ATP w warunkach fizjologicznych ujawniło kluczowe szczegóły dotyczące sposobu poruszania się tego białka w poszczególnych ścieżkach. MINFLUX umożliwił niemal śledzenie na poziomie protofilamentu tego motorowego białka na mikrotubulu (narysowanym na szaro) i podkreśla skuteczność MINFLUX jako narzędzia do monitorowania zmian konformacyjnych w białkach. (Zdjęcie: MPI dla badań medycznych)

Naukowcy*ki z Nagrodzonym*ą Noblem Stefanem Hell z Instytutu Maxa Plancka ds. Badań Medycznych w Heidelbergu opracowali superrozdzielcze mikroskop z przestrzenno-czasową dokładnością jednego nanometra na milisekundę. Jest to ulepszona wersja niedawno wprowadzonej przez grupę Hell mikroskopii MINFLUX. Wysokorozdzielczy mikroskop umożliwia szczegółowe obserwowanie nawet najmniejszych ruchów pojedynczych białek, jak nigdy dotąd. W tym badaniu zbadali krokowy ruch motorowego białka Kinesin-1, które porusza się wzdłuż mikrotubul w komórce. Wyniki podkreślają potencjał MINFLUX jako rewolucyjnego narzędzia do obserwacji zmian konformacyjnych w białkach w zakresie nanometrów. Praca została niedawno opublikowana w czasopiśmie Science.

Aby rozwiązać wydarzenia wewnątrz komórki, musimy zrozumieć biochemię pojedynczych białek. Jednym z największych wyzwań jest pomiar najdrobniejszych zmian położenia i kształtu. Mikroskopia fluorescencyjna, zwłaszcza superrozdzielcza mikroskopia (tzw. nanoskopia), stała się nieodzowna w tych badaniach. MINFLUX, jeden z najnowszych metod nanoskopicznych opartych na fluorescencji, osiągnął już przestrzenną rozdzielczość od jednego do kilku nanometrów: rozmiar małych cząsteczek organicznych. Jednak aby posunąć nasze rozumienie molekularnej fizjologii komórkowej do przodu, konieczne są obserwacje z jeszcze wyższą rozdzielczością przestrzenno-czasową.

Maxymalizacja możliwości MINFLUX

Gdy grupa Stefana Hella po raz pierwszy zaprezentowała MINFLUX w 2016 roku, można było nim śledzić już fluorescencyjnie oznakowane białka w komórkach. Ruch białek był jednak przypadkowy, a dokładność pomiarów mieściła się w zakresie dziesięciu nanometrów. Badanie opublikowane w tym tygodniu w czasopiśmie Science jest pierwszym, które wykorzystuje dotychczas nieosiągalną przestrzenno-czasową rozdzielczość MINFLUX do badania zmian konformacyjnych białek, w szczególności motorowego białka Kinesin-1. W tym celu naukowcy z Heidelberga opracowali nową wersję MINFLUX, aby obserwować ruch pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych.

Dotychczasowe metody pomiaru dynamiki białek są mocno ograniczone w zdolności do rejestrowania kluczowego zakresu (sub-)nanometrów / (sub-)milisekund. Niektóre zapewniają wysoką rozdzielczość przestrzenną do kilku nanometrów, ale nie mogą śledzić zmian wystarczająco szybko. Inne mają wysoką rozdzielczość czasową, ale wymagają oznakowania za pomocą światłowstrząsających kulek (np. złotych, germanowych lub lateksowych), które są dwie do trzech rzędów wielkości większe od badanej cząsteczki białka. Może to znacząco wpływać na funkcję białka, uniemożliwiając obserwację jego rzeczywistej funkcji. Natomiast w przypadku MINFLUX wystarczy, aby do białka przyczepiona była zwykła cząsteczka fluorescencyjna o rozmiarze około 1 nanometra. Dzięki temu MINFLUX może osiągnąć wysoką rozdzielczość, nie zakłócając funkcji białka. Jest to niezbędne do badania ruchu naturalnych białek. „Mikroskop MINFLUX, odizolowany od szumu otoczenia i pracujący blisko granic teoretycznych, jest jednym z wyzwań” – mówi Otto Wolff, doktorant w grupie. „A przeprowadzenie eksperymentów tak, aby nie wpływały na funkcję białka, a jednocześnie ukazywały mechanizm biologiczny, to drugie wyzwanie” – dodaje jego kolega Lukas Scheiderer.

Nowo zaprezentowany przez grupę mikroskop MINFLUX może rejestrować ruchy białek z przestrzenno-czasową dokładnością do 1,7 nanometra na milisekundę. Do tego mikroskop potrzebuje jedynie około 20 fotonów emitowanych przez cząsteczkę fluorescencyjną.

„Jestem przekonany, że właśnie otwieramy nowy rozdział w badaniach ruchów i zmian kształtu pojedynczych cząsteczek białek” – mówi Stefan Hell. „Połączenie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, które oferuje MINFLUX, umożliwi naukowcom badanie biomolekuł w sposób dotąd niemożliwy”.

Rozdzielczość krokowego ruchu Kinesin-1 z ATP w warunkach fizjologicznych

Kinesin-1 odgrywa kluczową rolę w transporcie ładunków przez nasze komórki, a mutacje tego białka są przyczyną wielu chorób. Kinesin-1 „kroczy” po filamentach (mikrotubulach), które przecinają nasze komórki niczym sieć dróg. Ruch ten można dosłownie wyobrazić jako „krok”, ponieważ białko ma dwie „nogi”, które w literaturze fachowej nazywane są „głowami”, i które na przemian zmieniają swoje położenie na mikrotubulach. Ruch ten zwykle przebiega wzdłuż jednego z 13 protofilamentów tworzących mikrotubulę. Postęp tych „głów” jest napędzany przez rozkład głównego źródła energii komórki, ATP (adenozynotrifosforan).

Naukowcy oznakowali Kinesin-1 za pomocą zaledwie jednej cząsteczki fluorescencyjnej i zarejestrowali regularne kroki o szerokości około 16 nanometrów, jak również podkroki tego procesu, które dotąd nie były obserwowane. Przestrzenno-czasowa rozdzielczość mieściła się w zakresie nanometrów na milisekundę. Wyniki pokazują, że ATP jest pobierane, gdy tylko jeden z głów jest związany z mikrotubulą. Natomiast hydroliza ATP zachodzi, gdy oba „głowy” są związane. Zaobserwowano, że podczas kroku „łodyga” białka obraca się. To ta część molekuły kinesinu, która trzyma ładunek. Dzięki wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej MINFLUX udało się także zaobserwować obrót głowy w początkowej fazie każdego kroku. Pomiarów dokonano przy fizjologicznych stężeniach ATP, co wcześniej nie było możliwe.

Przyszły potencjał w badaniach ruchów białek

„Ciekawi mnie, dokąd jeszcze zaprowadzi nas MINFLUX. Dodaje on nowy wymiar do badania funkcjonowania białek. Może nam pomóc zrozumieć molekularne mechanizmy wielu chorób i ostatecznie przyczynić się do opracowania terapii” – dodaje Jessica Matthias, była doktorantka w grupie Stefana Hella, która obecnie w spółce zależnej Max Planck Institute bada zastosowanie MINFLUX w różnych zagadnieniach biologicznych.