Effet fongicide des désinfectants à base d'ammonium quartenaire acceptés mondialement

Tableau I

Figure 1

Tableau II

Tableau III

Tableau IV

Tableau V

Figure 2

RÉSUMÉ

Les composés quaternaires d'ammonium (CQA) sont d'excellents agents actifs dans les produits de désinfection, car ils présentent une faible toxicité, une bonne activité nettoyante et une efficacité bactéricide. Malheureusement, de nombreux produits CQA disponibles sur le marché aujourd'hui sont incompatibles avec certaines méthodes de stérilisation et ont une efficacité fongicide insuffisante. Ces inconvénients peuvent conduire à éviter l'utilisation de désinfectants à base de CQA dans des salles blanches ISO-5. De plus, certains CQA ne sont acceptés que de manière limitée par certains organismes en Europe. Les études décrites ici prouvent qu'un produit contenant du chlorure de didécyldiméthylammonium (un CQA) agit contre des génotypes de champignons, par exemple Aspergillus brasiliensis, est stable sous irradiation et respecte les normes mondiales en matière de compatibilité environnementale.

INTRODUCTION

Les composés quaternaires d'ammonium ont été utilisés comme agents actifs dans les désinfectants pour surfaces dures depuis les années 1930, et aujourd'hui, des centaines de variantes sont disponibles. Ces composés sont structurés comme suit : autour d’un atome d’azote chargé positivement, quatre groupes organiques (1). Au fil des années, différentes CQA ont été développées, toutes présentant des combinaisons variées de groupes alkyles et aromatiques liés à l’azote. Ces formulations sont désormais utilisées dans le monde entier (2).

Un facteur important influençant le choix d’un CQA pour une formulation de désinfectant est la question de son acceptation par les autorités de contrôle, telles que l’Environmental Protection Agency (EPA) aux États-Unis et la directive du Parlement européen concernant la mise sur le marché des biocides (directive biocide). Le nombre de CQA enregistrés auprès de l’EPA et activement soutenus par la directive biocide est relativement faible. Seuls les agents actifs tels que le chlorure de didécyldiméthylammonium et le chlorure d’alkylbenzylammonium (3,4) en font partie. Cela peut rendre le choix d’un désinfectant à base de CQA difficile pour les entreprises pharmaceutiques internationales souhaitant harmoniser leurs réglementations mondiales. Ce défi est encore accru lorsqu’il s’agit de sélectionner un désinfectant pour une utilisation en environnement contrôlé.

Les produits de désinfection doivent être stérilisés avant leur utilisation en salle blanche (5). Une méthode de stérilisation consiste à exposer le produit et son emballage à des rayons gamma. Les CQA avec groupes alkyles ont démontré une meilleure stabilité lors de l’irradiation gamma que ceux avec groupes aromatiques. Lorsqu’un CQA aromatique est soumis à la radiation gamma, la liaison entre l’azote et le reste du molécule peut se rompre, entraînant la formation d’amines en sous-produits. Le tableau I compare la stabilité d’une formulation aromatique de CQA sous irradiation gamma à celle d’une formulation alkyle. La dégradation du CQA alkyle par irradiation gamma est minimale, alors que celle du CQA aromatique est significative et augmente avec la dose d’irradiation (6). (Voir Tab. I)

En équilibrant les critères réglementaires avec la stabilité souhaitée lors de l’irradiation, le chlorure de didécyldiméthylammonium apparaît comme le meilleur choix parmi tous les CQA restants pouvant être utilisés dans une formulation de désinfectant à usage mondial. (Voir Fig. 1)

Bien que le chlorure de didécyldiméthylammonium réponde aux exigences pour une utilisation mondiale, certains CQA manquent d’un spectre d’action large. D’un côté, certains produits CQA démontrent une activité bactéricide et virucide, mais, de l’autre, ils manquent de l’efficacité nécessaire contre certains types de champignons en raison de mécanismes de résistance spécifiques et de la nature des spores fongiques, plus résistantes à la désinfection (7). Les conséquences d’une contamination fongique peuvent être importantes et entraîner des problèmes à long terme dans une installation. Dans des lettres d’avertissement et des rapports de non-conformité (Formulaire 483) de la FDA (Food and Drug Administration), il est souvent indiqué que les désinfectants utilisés dans une installation sont insuffisamment efficaces contre les champignons (8,9).

Un génotype fongique particulier, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (anciennement connu sous le nom d’Aspergillus niger ATCC 16404), s’est avéré être un défi difficile pour les entreprises pharmaceutiques et n’est pas atteint par la majorité des désinfectants à base de CQA (10). Dans de nombreux cas, des sporesides et des désinfectants tels que l’eau de Javel (hypochlorite de sodium), le peroxyde d’hydrogène, l’acide peracétique, le dioxyde de chlore, l’ozone, le glutaraldéhyde, l’iode et les phénols sont utilisés dans des applications où une efficacité contre Aspergillus brasiliensis est requise. Cependant, l’utilisation de certains de ces composés peut poser des problèmes de sécurité, d’environnement, d’odeur ou de coloration. Un désinfectant à base de CQA avec des revendications d’efficacité reconnues contre Aspergillus brasiliensis constitue une alternative fiable pour cette application.

Lors de la formulation d’un désinfectant à base de CQA, il est possible de choisir des ingrédients tels qu’une source d’alcalinité, un agent chélatant, un solvant auxiliaire ou un tensioactif pour améliorer l’efficacité d’une formulation à base de chlorure de didécyldiméthylammonium. Ces ingrédients remplissent également les conditions du règlement REACh (REACh signifie Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals, soit en français : enregistrement, évaluation, autorisation et restriction des substances chimiques) (11). Le respect de ce règlement pour toutes les formulations commercialisées dans l’Union européenne est obligatoire.

Les tests décrits dans cet article ont été réalisés sur une formulation à base de chlorure de didécyldiméthylammonium, qui a été évaluée contre différents génotypes de champignons selon des méthodologies approuvées par l’Europe et les États-Unis (EPA).

MATERIELS ET MÉTHODES

Pour les tests d’efficacité concernant les revendications sur l’étiquette des désinfectants américains et européens, il est nécessaire de respecter strictement les méthodes standard reconnues par les autorités compétentes. Les procédures sont résumées comme suit.

Méthode BS EN 1650 (12)

Préparation des micro-organismes de test. Des suspensions de Candida albicans ATCC 10231 et Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 ont été préparées et ajustées pour obtenir environ 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Des dilutions en série de dix ont été effectuées pour vérifier le nombre d’unités formant colonie (UFC) par ml dans la suspension d’inoculation.

Procédure de test. Un aliquote du désinfectant, dilué dans de l’eau dure avec 300 ppm de carbonate de calcium (CaCO3), a été placé dans un tube contenant la substance perturbatrice et une suspension fongicide, puis laissé en contact à 20 ±1 °C pendant le temps indiqué. Après le contact, 1,0 ml du mélange de test a été ajouté à une solution de neutralisation. Après une période de neutralisation de 5 minutes ±10 secondes, un échantillon de 1,0 ml de chaque mélange neutralisé a été déposé sur une boîte de Pétri stérile. De la gélose malt extrudée fondue (MEA) a été répartie sur chaque boîte. Après incubation, toutes les plaques ont été comptées et la valeur UFC/ml du mélange de test calculée. La validation et les contrôles correspondants ont été effectués simultanément lors de la procédure décrite selon BS EN 1650.

Méthode BS EN 13697 (13)

Préparation des micro-organismes de test. Des suspensions de Candida albicans ATCC 10231 et Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 ont été préparées et ajustées pour obtenir environ 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Des dilutions en série de dix ont été effectuées pour vérifier le nombre d’unités formant colonie (UFC) par ml dans la suspension d’inoculation. L’inoculum de test a été préparé en ajoutant 1 ml de chaque suspension fongicide à 1 ml de la substance perturbatrice (3,0 g de BSA dans 1 litre d’eau distillée), puis bien mélangé.

Procédure de test. Des disques en acier inoxydable propres et secs de deux centimètres de diamètre ont été placés dans des contenants stériles peu profonds. La surface de test a été inoculée avec 0,05 ml de l’inoculum préparé et laissée à sécher à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit visiblement sèche. Un aliquote du désinfectant a été déposé sur chaque surface de test, en s’assurant que l’inoculum sec était complètement couvert. Après le temps d’exposition défini (5 min pour C. albicans et 15 min pour A. brasiliensis), 10 ml de la solution de neutralisation ont été ajoutés. Chaque contenant a été couvert et agité pendant 1 minute pour éliminer tous les cellules/spores restants des surfaces. Après une période de neutralisation de 5 min ±10 s, la suspension neutralisée a été diluée en série, et un échantillon de 1,0 ml de chaque dilution a été déposé en double sur des boîtes de Pétri stériles. Ensuite, la gélose MEA fondue a été ajoutée. La surface de test a été retirée, rincée avec 10 ml d’eau distillée, puis placée face vers le haut sur une boîte de Pétri contenant environ 10 ml de MEA solidifiée. Un aliquote d’eau distillée stérile a été déposé sur la plaque, puis la surface a été frottée avec une spatule stérile pendant 1 minute pour éliminer tout résidu d’inoculum sec. 10 ml supplémentaires de MEA fondue ont été versés sur la plaque. Après incubation, toutes les plaques ont été comptées pour le nombre d’unités formant colonie. La validation et les contrôles ont été effectués simultanément selon la méthode BS EN 13697:2001.

Méthodologie fongicide selon l'AOAC (14)

Préparation des micro-organismes de test. Des cultures fongiques d’Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 et Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 ont été cultivées sur gélose au glucose Neopepton (NGA) à 25–30 °C pendant 7 à 10 jours. Les tapis mycéliens ont été détachés de la surface de l’agar et ramollis avec une solution saline dans un homogénéisateur stérile. Ensuite, une filtration à travers de la laine de verre stérile a été effectuée. Les inocula finaux ont été préparés en ajoutant la quantité appropriée de sérum de veau fœtal (FBS) à chaque culture pour obtenir un mélange à 5 %. La densité de chaque suspension conidienne a été déterminée par comptage sur plaque. Avant utilisation, chaque suspension a été normalisée avec une solution saline pour produire environ 5,0 x 10^6 conidies/ml.

Procédure de test. Deux tubes d’essai de 25 x 150 mm contenant chacun 5 ml, représentant chaque lot de substances de test, ont été calibrés à 20 ±2 °C. 0,5 ml de l’inoculum fongicide normalisé a été ajouté à chaque tube et agité. Après un contact de 10 minutes à 20 ±2 °C, un échantillon de chaque tube a été transféré à 10 ml du neutralisant approprié à l’aide d’une pince microbiologique de 4 mm de large. La procédure a été répétée pour tous les tubes. Des contrôles correspondants ont été réalisés conformément à la méthode officielle AOAC 955.17 « Activité fongicide des désinfectants ». Après chaque transfert, les tubes ont été soigneusement agités, puis incubés à 25–30 °C pendant 7 à 10 jours. Après incubation, ils ont été examinés pour la présence ou l’absence de croissance.

Méthode « Temps de contact »

Préparation des micro-organismes de test. Une culture de champignon d’Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 a été cultivée sur gélose Sabouraud-Dextrose (SDA) pendant 7 à 10 jours à 25–30 °C. Le milieu de travail microbiologique a été préparé en détachant les tapis mycéliens de la surface de l’agar et en les ramollissant avec une solution saline dans un homogénéisateur stérile.  

Procédure de test. 0,1 ml du milieu de travail a été transféré dans 9,9 ml du désinfectant. Après des temps de contact de 1, 5 et 10 minutes, un échantillon de 0,1 ml a été transféré dans 10 ml du neutralisant. Ensuite, des dilutions en série de dix ont été préparées, puis plaquées et recouvertes de SDA. Les plaques ont été incubées à 30 °C pendant 5 à 7 jours. Les contrôles ont été réalisés de la même manière, mais en utilisant un tampon au lieu du désinfectant. Les valeurs en log10 des UFC/ml ont été calculées pour les contrôles et les échantillons. Les valeurs de réduction en log10 représentent la différence entre la moyenne des valeurs de contrôle en log10 et celles des échantillons.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Le BS EN 1650 est un test de suspension quantitatif utilisé pour évaluer l’activité fongicide des désinfectants. Étant donné que les conditions du test sont représentatives d’une utilisation pratique, cette méthode peut être utilisée pour des revendications générales d’efficacité des désinfectants dans de nombreux pays européens. Le critère d’acceptation pour le test est une réduction ≥ 4 log10 du nombre de micro-organismes vivants (Log R). Le tableau II montre que le produit testé, dilué dans de l’eau dure à un ratio de 1:128 et testé dans des conditions contaminées à 20 ±1 °C, a atteint un Log R supérieur à 4,5, prouvant une activité fongicide contre Candida albicans ATCC 10231 pendant plus de 5 minutes. Le tableau III montre que le même produit, dilué dans de l’eau dure à un ratio de 1:32 et testé dans des conditions contaminées à 20 ±1 °C, a atteint un Log R supérieur à 4,6, prouvant une activité fongicide contre Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 pendant plus de 15 minutes.

Le BS EN 13697 est un test quantitatif de surface permettant de vérifier que les produits ont une activité microbicide contre les micro-organismes adhérant aux surfaces. Le critère d’acceptation pour l’activité fongicide est une réduction ≥ 3 log10, la valeur étant calculée comme la valeur microbicide (valeur ME). Le tableau IV montre que le produit testé, dilué dans de l’eau dure à un ratio de 1:128 et testé dans des conditions sales (3 g/l BSA) à 20 ±1 °C, a atteint une valeur ME supérieure à 5,66, prouvant une activité fongicide contre Candida albicans ATCC 10231 pendant plus de 15 minutes. 

Le tableau V montre que le même produit, dilué dans de l’eau dure à un ratio de 1:32 et testé dans des conditions contaminées (3 g/l BSA) à 20 ±1 °C, a atteint une valeur ME supérieure à 5,66, prouvant une activité fongicide contre Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 pendant plus de 15 minutes.

Aux États-Unis, l’activité fongicide est déterminée selon la méthode officielle AOAC 955.17 « Activité fongicide des désinfectants ». Les résultats ont montré que le produit testé, après un temps de contact de 10 minutes, était efficace contre Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 et Aspergillus niger ATCC 6275, lorsqu’il était dilué à 1:128 dans 400 ppm d’eau dure et testé en présence d’une charge organique par 5 % de FBS (fœtal bovine serum) selon le test AOAC, sans croissance observée dans un des réplicats. Le produit a également démontré une efficacité après 10 minutes contre Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, lorsqu’il était dilué à 1:64 dans 400 ppm d’eau dure et testé en présence de la charge organique mentionnée. Des essais ont montré que Trichophyton mentagrophytes répondait plus fortement au désinfectant qu’Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (15). 

La réaction de base des produits contenant des CQA sur Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 peut être évaluée à l’aide d’un test de suspension de temps de décontamination, comme le montre la figure II. Les produits A et B sont des nettoyants ménagers prêts à l’emploi (désinfectants à base de CQA), et les produits C, D, E et F sont des désinfectants à base de CQA destinés à un usage pharmaceutique. Le produit C contient également une biguanide. 

Les résultats de la figure II démontrent l’importance d’une formulation correcte lors du développement de désinfectants à base de CQA. Une différence significative dans l’efficacité contre Aspergillus brasiliensis peut être constatée, sans que celle-ci ne soit directement liée au type de principe actif, à la concentration ou à l’application pratique.