Fungicidní účinek celosvětově uznávaných čtvrtletních amonných dezinfekčních prostředků

Tabulka I

Obrázek 1

Tabulka II

Tabulka III

Tabulka IV

Tabulka V

Obrázek 2

ABSTRAKT

Čtvrtečné amonné sloučeniny (QAV) jsou vynikajícími účinnými látkami v produktech určených k dezinfekci, neboť vykazují nízkou toxicitu, dobrou čisticí aktivitu a baktericidní účinnost. Bohužel mnoho dnes dostupných QAV produktů je neslučitelných s některými sterilizačními metodami a vykazuje nedostatečnou fungicidní účinnost. Tyto nevýhody mohou vést k tomu, že použití QAV dezinfekčních prostředků v čistých prostorách podle ISO-5 je vyhýbáno. Navíc jsou některé QAV v některých evropských zemích akceptovány pouze omezeně. Studie popsané zde dokazují, že produkt obsahující Didecyldimethylammoniumchlorid (jednu z QAV) má účinek proti genotypům hub, např. Aspergillus brasiliensis, je stabilní při ozáření a splňuje globální normy týkající se ekologické šetrnosti.

ÚVOD

Čtvrtečné amonné sloučeniny byly používány jako účinné látky v dezinfekčních prostředcích na tvrdé povrchy již od 30. let minulého století a dnes je k dispozici stovky jejich variant. Tyto sloučeniny jsou strukturovány následovně: kolem pozitivně nabitého dusíkového atomu je čtyři organické skupiny (1). V průběhu let byly vyvinuty různé QAV, které mají různé kombinace alkylových a aromatických skupin vázaných na dusíkový atom. Tyto receptury jsou nyní používány po celém světě (2).

Významným faktorem ovlivňujícím výběr QAV pro dezinfekční recepturu je otázka akceptace QAV příslušnými kontrolními orgány, např. United States Environmental Protection Agency (EPA) a směrnicí Evropského parlamentu o uvádění biocidních výrobků na trh (směrnice o biocidech). Počet QAV registrovaných u EPA a aktivně podporovaných v rámci směrnice o biocidech je poměrně malý. Patří sem pouze účinné látky jako Didecyldimethylammoniumchlorid a Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (3,4). To může ztížit výběr čtvrtečného amonného dezinfekčního prostředku pro mezinárodní farmaceutické koncerny, které mají zájem o sjednocení globálně platných pracovních předpisů. Tato výzva je ještě větší při výběru dezinfekčního prostředku pro použití v kontrolovaném prostředí.

Dezinfekční produkty musí být před použitím v čistých prostorách sterilizovány (5). Jednou z metod sterilizace produktu a jeho obalu je ozáření gama zářením. QAV s alkylovými skupinami prokázaly lepší stabilitu při gamma záření než QAV s aromatickými skupinami. Pokud je aromatická QAV vystavena gamma záření, může dojít k uvolnění vazby mezi dusíkovým atomem a aromatickou částí molekuly, což může vést ke vzniku amoniaků jako vedlejších produktů. Tabulka I porovnává stabilitu aromatické QAV receptury při gamma záření s stabilitou alkylové QAV receptury. Rozklad alkylové QAV při gamma záření je minimální, zatímco rozklad aromatické QAV je značný a s rostoucí dávkou záření se zvyšuje (6). (Viz Tab. I)

Při vážení regulatorních kritérií proti požadované stabilitě při ozáření je Didecyldimethylammoniumchlorid nejlepší volbou ze všech dostupných QAV vhodných pro globálně použitelnou dezinfekční recepturu (viz Obr. 1).

Ačkoliv Didecyldimethylammoniumchlorid splňuje požadavky na globální použití, chybí některým QAV široké spektrum účinku. Na jedné straně některé QAV produkty vykazují baktericidní a virucidní účinek, na druhé straně jim chybí požadovaná účinnost proti určitým druhům hub kvůli různým mechanismům specifické rezistence a vlastnostem hubových spor, které jsou odolnější vůči dezinfekci (7). Následky plísňového napadení mohou být závažné a vést k dlouhodobým problémům v provozu. V upozorněních a hlášeních nedostatků (Formulář 483) FDA (Food and Drug Administration) jsou často uváděny nedostatečné opatření proti plísňovému napadení a absence záruky, že dezinfekční prostředky používané v zařízení jsou účinné proti plísním (8,9).

Určitý genotyp houby, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (dříve známý jako Aspergillus niger ATCC 16404), se ukázal jako obtížná výzva pro farmaceutické firmy a většina dezinfekčních prostředků založených na QAV jej nedokáže účinně zlikvidovat (10). V mnoha případech jsou používány sporizidní přípravky a dezinfekční prostředky jako bělidlo (sodný hypochlorit), peroxid vodíku, peroxosírová kyselina, chlordioxid, ozon, glutaraldehyd, jod a fenoly, tam, kde je požadována účinnost proti Aspergillus brasiliensis. Použití některých z těchto látek však může přinést bezpečnostní, ekologické, zápachové nebo zbarvovací problémy. Dezinfekční prostředek na bázi QAV s uznávanými účinky proti Aspergillus brasiliensis představuje pro uživatele jistou alternativu v této oblasti použití.

Při formulaci dezinfekčního prostředku na bázi QAV lze zvolit složky, jako je zásobníkový zdroj alkalií, komplexotvorná látka, přídavný rozpouštědlo nebo tenzid, ke zlepšení účinku receptury založené na Didecyldimethylammoniumchloridu. Tyto složky splňují také podmínky nařízení REACh (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals). Dodržování tohoto nařízení je povinné pro všechny receptury prodávané v Evropské unii.

Testy popsané v tomto článku byly provedeny na receptuře založené na Didecyldimethylammoniumchloridu. Receptura byla testována proti různým genotypům hub podle metodik schválených evropskými a americkými úřady, schválených EPA.

MATERIÁLY A METODY

Pro účinnostní testy týkající se označení amerických či evropských dezinfekčních prostředků je nutné přísně dodržovat příslušné standardní metody, které jsou uznány příslušnými orgány. Postupy jsou shrnuty následovně.

Metoda BS EN 1650 (12)

Příprava testovacích mikroorganismů. Připravily se suspenze Candida albicans ATCC 10231 a Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 tak, aby dosahovaly cca 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml. Byly provedeny desetkrát sériové ředění, aby se ověřil počet kolonií tvořících jednotek (KBE) na ml v inokulační suspenzi.

Testovací postup. Do zkumavky bylo vloženo 0,5 ml dezinfekčního prostředku zředěného v tvrdé vodě s 300 ppm uhličitanu vápenatého (CaCO3), obsahujícího i zkušební suspensii, a ponecháno při 20 ±1 °C po stanovenou dobu kontaktu. Po uplynutí doby kontaktu bylo přidáno 1,0 ml testovací směsi do neutralizačního roztoku. Po neutralizační době 5 minut ±10 sekund bylo odebráno 1,0 ml zneutralizované směsi na sterilní Petriho misku. Na každou misku bylo rozloženo roztavené agarové médium (ME). Po inkubaci byly všechny desky spočítány a vypočtena hodnota KBE/ml testovací směsi. Během testu podle BS EN 1650 byla současně provedena validace a kontrolní opatření.

Metoda BS EN 13697 (13)

Příprava testovacích mikroorganismů. Připravily se suspenze Candida albicans ATCC 10231 a Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 tak, aby dosahovaly cca 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml. Byly provedeny desetkrát sériové ředění, aby se ověřil počet KBE na ml v inokulační suspenzi. Testovací inokulum bylo připraveno tak, že 1 ml fungicidní suspensio bylo přidáno do 1 ml zkušebního roztoku (3,0 g BSA v 1 litru destilované vody) a dobře promícháno.

Testovací postup. Čisté, suché nerezové destičky o průměru 2 cm byly umístěny do plochých sterilních nádob. Povrch testovacího vzorku byl naočkován 0,05 ml připravené inokula a vysušen při 37 °C, dokud nebyl viditelně suchý. Na každý povrch bylo umístěno 0,05 ml dezinfekčního prostředku tak, aby byl úplně pokryt. Po stanovené době působení (5 minut pro C. albicans a 15 minut pro A. brasiliensis) bylo přidáno 10 ml neutralizačního roztoku. Každý obal byl zakryt a promíchán po dobu 1 minuty, aby se odstranily všechny zbývající buňky/spory z povrchů. Po neutralizační době 5 min ±10 s bylo neutralizované směsi sériově ředěno a odebráno 1,0 ml z každé ředěné dávky do jednotlivých sterilních Petriho misek, dvakrát opakováno. Poté bylo přidáno roztavené ME. Povrch byl odstraněn, opláchnut destilovanou vodou (10 ml) a položen na Petriho misku s asi 10 ml ztuhlého ME. Na skleněnou destičku bylo naneseno 0,5 ml sterilního destilovaného vody a povrch byl sterilním špachtlí po dobu 1 minuty vyškrábán, aby se odstranily zbytky suché inokula. Dalších 10 ml roztaveného ME bylo nalito přes povrch. Po inkubaci byly všechny desky spočítány a zaznamenán počet kolonií. Během testu podle BS EN 13697:2001 byla současně provedena validace a kontrolní opatření.

Fungicidní metodika podle AOAC (14)

Příprava testovacích mikroorganismů. Kultury hub Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 a Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 byly pěstovány na Neopepton-Glucose agar (NGA) při 25–30 °C po dobu 7 až 10 dnů. Myceliální plaky byly odstraněny z povrchu agar a rozmělněny fyziologickým roztokem v sterilní skleněné drtičce. Následně byla provedena filtrace přes sterilní skleněnou vatu. Konečné inokula byla připravena přidáním odpovídajícího množství fetálního bovinního séra (FBS) do každé kultury, aby vznikla 5% směs. Hustota konidiové suspenze byla stanovena pomocí plošného počítání. Před použitím byly suspenze normalizovány fyziologickým roztokem tak, aby obsahovaly cca 5,0 x 10^6 konidií na ml.

Testovací postup. Pro každý testovací mikroorganismus byly dvě zkumavky o rozměrech 25 x 150 mm s obsahem 5 ml, reprezentující každou šarži testovacích látek, nastaveny na teplotu 20 ±2 °C. Do každé zkumavky bylo přidáno 0,5 ml normalizovaného, filamentózního fungicidního inokula a promícháno. Po 10 minutách kontaktu při 20 ±2 °C byla odebrána vzorka z každé zkumavky pomocí mikrobiologické šňůrky o šířce 4 mm a převedena do 10 ml příslušného neutralizačního prostředku. Tento krok byl opakován u všech zkumavek. Kontroly byly provedeny podle popisu v oficiální metodě AOAC 955.17 „Fungicidní aktivita dezinfekčních prostředků“. Po každém přenosu byly zkumavky důkladně protřepány a inkubovány po dobu 7 až 10 dnů při 25–30 °C. Po inkubaci byly zkumavky zkontrolovány na přítomnost nebo nepřítomnost růstu.

Metoda „Doba působení“

Příprava testovacích mikroorganismů. Kultury plísní Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 byly pěstovány na Sabouraud-Dextrose agar (SDA) po dobu 7 až 10 dnů při 25–30 °C. Mikrobiální pracovní živný médium bylo připraveno tak, že myceliální plaky byly odstraněny z povrchu agar a rozmělněny fyziologickým roztokem v sterilní skleněné drtičce.

Testovací postup. 0,1 ml pracovního živného média bylo přidáno do 9,9 ml dezinfekčního prostředku. Po kontaktní době 1, 5 a 10 minut byla odebrána vzorka 0,1 ml z každé zkumavky a převedena do 10 ml neutralizačního roztoku. Následně byly provedeny sériové desetkrát ředění, plošné rozložení a pokrytí na SDA. Desky byly inkubovány po dobu 5–7 dnů při 30 °C. Kontroly byly provedeny stejným způsobem, avšak místo dezinfekčního prostředku byl použit buffer. Logaritmické hodnoty KBE/ml byly vypočteny pro kontrolní a testované vzorky. Redukční hodnoty log10 představují rozdíl mezi průměrnými hodnotami kontrolních vzorků a hodnotami testovaných vzorků.

VÝSLEDKY A DISKUSE

BS EN 1650 je kvantitativní suspensionový test používaný k posouzení fungicidní účinnosti dezinfekčních prostředků. Vzhledem k tomu, že podmínky testu jsou reprezentativní pro praktické použití, lze tuto metodu použít pro obecné tvrzení o účinnosti dezinfekčních prostředků v mnoha evropských zemích. Přijímací kritérium pro test je ≥ 4 log10 redukce počtu živých mikroorganismů (Log R). Tabulka II ukazuje, že testovaný produkt, ředěný v tvrdé vodě v poměru 1:128 a testovaný za znečištěných podmínek při 20 ±1 °C, dosáhl Log R přes 4,5 a tak prokázal fungicidní účinek proti Candida albicans ATCC 10231 po dobu 5 minut. Tabulka III ukazuje, že testovaný produkt, ředěný v tvrdé vodě v poměru 1:32 a testovaný za znečištěných podmínek při 20 ±1 °C, dosáhl Log R přes 4,6 a tak prokázal fungicidní účinek proti Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 po dobu 15 minut.

BS EN 13697 je kvantitativní test povrchu, který slouží k prokázání, že produkty mají mikrobiocidní účinek proti mikroorganismům přiléhajícím k povrchům. Přijímací kritérium pro fungicidní účinek je ≥ 3 log10 redukce; hodnota je vypočítána jako mikrobiocidní účinek (ME-hodnota). Tabulka IV ukazuje, že testovaný produkt, ředěný v tvrdé vodě v poměru 1:128 a testovaný za špinavých podmínek (3 g/l BSA) při 20 ±1 °C, dosáhl ME-hodnoty přes 5,66 a tak prokázal fungicidní účinek proti Candida albicans ATCC 10231 po dobu 15 minut. 

Tabulka V ukazuje, že testovaný produkt, ředěný v tvrdé vodě v poměru 1:32 a testovaný za znečištěných podmínek (3 g/l BSA) při 20 ±1 °C, dosáhl ME-hodnoty přes 5,66 a tak prokázal fungicidní účinek proti Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 po dobu 15 minut.

Ve Spojených státech je fungicidní účinek stanoven podle oficiální metody AOAC 955.17 „Fungicidní aktivita dezinfekčních prostředků“. Výsledky ukázaly, že testovaný produkt byl po 10 minutách účinný proti Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 a Aspergillus niger ATCC 6275, pokud byl ředěn v poměru 1:128 v 400 ppm tvrdé vody a testován za přítomnosti organické zátěže pomocí 5% Fetal Bovine Serum (FBS). Produkt také prokázal účinnost po 10 minutách proti Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, pokud byl ředěn v poměru 1:64 v 400 ppm tvrdé vody a testován za přítomnosti organické zátěže. Výsledky ukázaly, že Trichophyton mentagrophytes reagoval na dezinfekční prostředek silněji než Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (15). 

Základní účinek produktů obsahujících QAV na Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 lze určit pomocí suspensionního testu doby působení, jak ukazuje obrázek II. Produkty A a B jsou hotové domácí čisticí prostředky (QAV-čističe/dezinfekční prostředky) a produkty C, D, E a F jsou dezinfekční prostředky na bázi QAV určené pro farmaceutické použití. Produkt C navíc obsahuje biguanid. 

Výsledky na obrázku II dokazují důležitost správné formulace při vývoji dezinfekčních prostředků na bázi QAV. Významný rozdíl ve účinnosti proti Aspergillus brasiliensis lze zaznamenat, že však není přímo korelován s typem účinné látky, její koncentrací nebo praktickým použitím. 

ZÁVĚREČNÁ POZNÁMKA

Použití dezinfekčního prostředku založeného na čtvrtečné amonné sloučenině přináší několik výhod. Patří mezi ně vynikající čisticí aktivita, nízká toxicita a baktericidní i virucidní účinek. Ne všechny receptury s čtvrtečnými amonnými sloučeninami však mají fungicidní účinek jako jiné účinné látky, a dostupné QAV na trhu mohou mít velmi odlišné vývojové stádium, pokud jde o účinnost proti sporám hub. Správně formulovaný dezinfekční prostředek na bázi QAV však může účinně působit proti náročným druhům hub, jako je Aspergillus brasiliensis, aniž by bylo nutné slevit z dalších důležitých vlastností, jako jsou globálně akceptované složky, ekologická šetrnost nebo stabilita při ozáření v koncentrované formě. 

SEZNAM LITERATURY

1. M. Cucci. Soap and Sanitary Chemicals. 25, 129-134,145 (1949). 

2. P. Schaeufele. J. Assoc. Ocs. 61, 387-389 (1984). 

3. U. S. Environmental Protection Agency, Substance Registry Services, http://iaspub.epa.gov/sor_internet/registry/substreg/searchandretrieve/substancesearch/search.do, přístup 13. července 2011. 

4. Nařízení (ES) č. 2032/2003. Seznam účastníků/přihlášených do hodnotícího programu stávajících aktivních látek používaných v biocidních přípravcích, http://ec.europa.eu/environment/biocides/pdf/list_participants_applicants_subs.pdf, přístup 13. července 2011. 

5. FDA Guidance for Industry, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing – Current Good Manufacturing Practice, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, září 2004. 

6. Interní data společnosti STERIS Corporation, nezveřejněná. 

7. McDonnell, G.E. „Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance,“ ASM Press, Washington, DC, 2007. 

8. U.S. Food and Drug Administration, Inspections, Compliance, Enforcement, and Criminal Investigations, Medimmune, Inc. Warning Letter, 27. května 2007, http://www.fda.gov/ICECI/EnforcementActions/WarningLetters/2007/ucm076398.htm, přístup 9. května 2011. 

9. GMP Trends Inc., Issue 766, 15. prosince 2008. 

10. Polarine, J., Macauley, J., Karanja, P., Klein, D., Martin, A., „Evaluating the Activity of Disinfectants Against Fungi,“ Cleanrooms: The Magazine of Contamination Control Technology, 23 (2), únor 2009. 

11. Nařízení (ES) č. 1907/2006 Evropského parlamentu a Rady ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolení a omezení chemických látek (REACH), zřizující agenturu pro chemické látky Evropské unie, měnící směrnici 1999/45/ES a zrušující nařízení Rady (EHS) č. 793/93 a nařízení Komise (ES) č. 1488/94, dále směrnice Rady 76/769/EHS a směrnice Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/EC a 2000/21/EC, http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32006R1907:EN:NOT, přístup 11. července 2011. 

12. BS EN 1650:2008. Chemické dezinfekční prostředky a antiseptika – Kvantitativní suspensionový test pro hodnocení fungicidní aktivity chemických dezinfekčních prostředků a antiseptik používaných v potravinářství, průmyslu, domácnostech a institucích (fáze 2, krok 1). Dostupné od British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., London W4 4AL, Velká Británie, http://www.bsi-global.com. 

13. BS EN 13697:2001. Chemické dezinfekční prostředky a antiseptika – Kvantitativní neporézní povrchový test pro hodnocení bakteriicidní a/nebo fungicidní aktivity chemických dezinfekčních prostředků používaných v potravinářství, průmyslu, domácnostech a institucích – Metoda testu a požadavky bez mechanického účinku (fáze 2/ krok 2). Dostupné od British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., London W4 4AL, Velká Británie, http://www.bsi-global.com. 

14. AOAC oficiální metoda 955.17 „Fungicidní aktivita dezinfekčních prostředků“, Oficiální metody analýzy AOAC, osmnácté vydání, AOAC International, 2005. 

15. Interní data společnosti STERIS Corporation, nezveřejněná.