Effetto fungicida dei disinfettanti a base di ammonio quartenario riconosciuti a livello mondiale

Tabella I

Figura 1

Tabella II

Tabella III

Tabella IV

Tabella V

Figura 2

ABSTRACT

I composti di ammonio quaternario (QAV) sono eccellenti principi attivi nei prodotti per la disinfezione, poiché presentano una bassa tossicità, una buona attività pulente e un'efficacia battericida. Purtroppo, molti dei prodotti QAV attualmente disponibili sul mercato sono incompatibili con alcuni metodi di sterilizzazione e mostrano un'efficacia fungicida insufficiente. Questi svantaggi possono portare a evitare l'uso di disinfettanti a base di QAV in ambienti puliti secondo ISO-5. Inoltre, alcuni QAV sono accettati solo in modo limitato da alcune autorità in alcuni paesi europei. Gli studi descritti qui dimostrano che un prodotto contenente didecil dimetil ammonio cloruro (uno di QAV) ha attività contro genotipi di funghi, ad esempio Aspergillus brasiliensis, è stabile sotto irradiazione e rispetta le norme globali di compatibilità ambientale.

INTRODUZIONE

I composti di ammonio quaternario sono stati utilizzati come principi attivi in disinfettanti per superfici dure sin dagli anni '30 del secolo scorso, e oggi sono disponibili centinaia di varianti. Questi composti sono strutturati come segue: un atomo di azoto positivamente carico è legato a quattro gruppi organici (1). Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi QAV, tutti con differenti combinazioni di gruppi alchilici e aromatici legati all'azoto. Queste formulazioni sono ora utilizzate in tutto il mondo (2).

Un fattore importante che influenza la scelta di un QAV per una formulazione disinfettante è la questione dell'accettazione da parte delle autorità di controllo, ad esempio l'Environmental Protection Agency (EPA) degli Stati Uniti e la direttiva del Parlamento Europeo sulla commercializzazione di biocidi (Direttiva sui biocidi). Il numero di QAV registrati presso l'EPA e attivamente supportati dalla direttiva sui biocidi è relativamente basso. Sono inclusi solo principi attivi come il didecil dimetil ammonio cloruro e il cloruro di alchil dimetilbenzilammonio (3,4). Ciò può rendere difficile la scelta di un disinfettante a base di ammonio quaternario per le multinazionali farmaceutiche interessate a uniformare le normative a livello globale. Questa sfida si fa ancora più grande quando si tratta di scegliere un disinfettante per l'uso in ambienti controllati.

I prodotti disinfettanti devono essere sterilizzati prima dell'uso in ambienti sterili (5). Un metodo di sterilizzazione del prodotto e del suo imballaggio consiste nell'irradiazione con raggi gamma. I QAV con gruppi alchilici hanno dimostrato di essere più stabili sotto irradiazione gamma rispetto ai QAV con gruppi aromatici. Quando un QAV aromatico viene sottoposto a irradiazione gamma, può verificarsi la rottura del legame tra l'azoto e il resto della molecola, portando alla formazione di ammine come sottoprodotti. La Tabella I confronta la stabilità di una formulazione di QAV aromatico sotto irradiazione gamma con quella di una formulazione di QAV alchilico. La decomposizione del QAV alchilico tramite irradiazione gamma è minima, mentre quella del QAV aromatico è significativa e aumenta con la dose di irradiazione (6). (Vedi Tab. I)

Valutando i criteri regolatori rispetto alla stabilità desiderata sotto irradiazione, il didecil dimetil ammonio cloruro risulta essere la scelta migliore tra tutti i QAV rimasti idonei per una formulazione disinfettante utilizzabile a livello globale. (Vedi Fig. 1)

Sebbene il didecil dimetil ammonio cloruro soddisfi i requisiti per un uso mondiale, alcune formulazioni di QAV mancano di un ampio spettro di attività. Da un lato, alcuni prodotti a base di QAV dimostrano attività battericida e virucida, ma dall'altro manca loro l'efficacia contro alcuni tipi di funghi a causa di vari meccanismi di resistenza specifica e della natura delle spore fungine, che sono più resistenti alla disinfezione (7). Le conseguenze di un'infestazione fungina possono essere significative e portare a problemi a lungo termine in un'azienda. In lettere di avvertimento e rapporti di non conformità (Form 483) della FDA (Food and Drug Administration), vengono spesso elencate misure insufficienti contro un'infestazione fungina e la mancanza di garanzie che i disinfettanti utilizzati siano efficaci contro i funghi (8,9).

Un genotipo fungino specifico, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (precedentemente noto come Aspergillus niger ATCC 16404), si è rivelato una sfida difficile per le aziende farmaceutiche e non viene raggiunto dalla maggior parte dei disinfettanti a base di QAV (10). In molti casi vengono utilizzati sporizidi e disinfettanti come candeggina (ipoclorito di sodio), perossido di idrogeno, acido peracetico, diossido di cloro, ozono, glutaraldeide, iodio e fenoli in applicazioni dove è richiesta efficacia contro Aspergillus brasiliensis. Tuttavia, l'uso di alcune di queste sostanze può comportare problemi di sicurezza, ambientali, olfattivi o di decolorazione. Un disinfettante a base di QAV con affermazioni di efficacia riconosciute contro Aspergillus brasiliensis rappresenta una valida alternativa sicura per questo ambito di applicazione.

Nella formulazione di un disinfettante a base di QAV, possono essere scelti ingredienti come una fonte di alcali, un chelante, un additivo solvente o un tensioattivo per migliorare l'efficacia di una formulazione a base di didecil dimetil ammonio cloruro. Questi ingredienti soddisfano anche le condizioni del regolamento REACh (REACH sta per Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals, ovvero registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche) (11). La conformità a questo regolamento è obbligatoria per tutte le formulazioni commercializzate nell'Unione Europea.

I test descritti in questo articolo sono stati condotti su una formulazione a base di didecil dimetil ammonio cloruro. La formulazione è stata testata contro diversi genotipi di funghi utilizzando metodologie approvate sia dall'Europa che dagli Stati Uniti, approvate dall'EPA.

MATERIALI E METODI

Per i test di efficacia relativi alle affermazioni di etichetta di disinfettanti statunitensi ed europei, è necessaria una rigorosa aderenza alle metodologie standard riconosciute dalle autorità competenti. I metodi sono riassunti come segue.

Metodo BS EN 1650 (12)

Preparazione dei microrganismi di prova. Sono state preparate sospensioni di Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, regolate per ottenere circa 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Sono state preparate diluizioni decimali seriali per verificare il numero di unità formanti colonie (UFC) per ml nella sospensione di inoculo.

Procedura di prova. Una aliquota del disinfettante, diluito in acqua dura con 300 ppm di carbonato di calcio (CaCO3), è stata posta in un tubo contenente la sostanza disturbante e una sospensione fungicida, e lasciata a contatto a 20 ±1 °C per il tempo indicato. Dopo il tempo di contatto, sono stati aggiunti 1,0 ml della miscela di prova in una soluzione di neutralizzazione. Dopo 5 minuti ±10 secondi di neutralizzazione, è stata distribuita una prova di 1,0 ml di ciascun campione neutralizzato su una piastra sterile. Su ogni piastra è stato distribuito agar malt extratto fuso (MEA). Dopo l'incubazione, tutte le piastre sono state contate e calcolato il valore di UFC/ml della miscela di prova. Durante il test secondo BS EN 1650 sono state effettuate anche validazioni e controlli appropriati.

Metodo BS EN 13697 (13)

Preparazione dei microrganismi di prova. Sono state preparate sospensioni di Candida albicans ATCC 10231 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, regolate per ottenere circa 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Sono state preparate diluizioni decimali seriali per verificare il numero di UFC/ml nella sospensione di prova. L'inoculo di prova è stato preparato aggiungendo 1 ml di ciascuna sospensione fungicida a 1 ml di sostanza disturbante (3,0 g di BSA in 1 litro di acqua distillata) e mescolando bene.

Procedura di prova. Sono state posizionate su superfici di acciaio inossidabile pulite e asciutte, con diametro di due centimetri, in contenitori sterili e piatti. La superficie di prova è stata inoculata con 0,05 ml della sospensione di prova preparata e lasciata asciugare a 37 °C fino a completa asciugatura visibile. Su ogni superficie di prova è stato applicato un aliquota del disinfettante, assicurandosi che l'inoculo essiccato fosse completamente coperto. Dopo il tempo di contatto stabilito (5 min per C. albicans e 15 min per A. brasiliensis), sono stati aggiunti 10 ml di soluzione di neutralizzazione. Ogni contenitore è stato coperto e agitato per 1 minuto per rimuovere tutte le cellule/spore dalle superfici. Dopo 5 minuti ±10 secondi di neutralizzazione, la sospensione neutralizzata è stata serialmente diluita e 1,0 ml di ciascuna diluizione è stata distribuita in doppio su piastre sterili. Successivamente, è stata aggiunta la MEA fusa. La superficie di prova è stata rimossa, risciacquata con 10 ml di acqua distillata e posta con il lato di prova rivolto verso l'alto su una piastra con circa 10 ml di MEA solidificata. Una aliquota di acqua sterile distillata è stata posta sulla piastra, e la superficie è stata raschiata con una spatola sterile per 1 minuto per rimuovere residui di inoculo essiccato. Altre 10 ml di MEA fusa sono state versate sulla piastra. Dopo l'incubazione, tutte le piastre sono state controllate e il numero di unità formanti colonie è stato annotato. Durante il test secondo BS EN 13697:2001 sono stati effettuati anche controlli di validità.

Metodo fungicida AOAC (14)

Preparazione dei microrganismi di prova. Sono state coltivate culture di funghi di Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 e Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 su agar Neopepton-Glucose (NGA) a 25–30 °C per 7-10 giorni. Le colonie di micelio sono state rimosse dalla superficie dell'agar e ammorbidite con soluzione salina in un trituratore di tessuti sterile. Successivamente, è stata effettuata una filtrazione con ovatta sterile. Gli inoculi finali sono stati preparati aggiungendo la quantità appropriata di siero di bovino fetale (FBS) a ogni coltura per ottenere una miscela al 5%. La densità di ogni sospensione di conidi è stata determinata tramite metodo di conta su piastra. Prima dell'uso, le sospensioni sono state normalizzate con soluzione salina per produrre circa 5,0 x 10^6 conidi/ml.

Procedura di prova. Per ogni microrganismo di prova, sono stati riempiti due tubi di prova da 25 x 150 mm con 5 ml di ciascuna, rappresentanti ogni lotto di sostanza di prova, e sono stati portati a 20 ±2 °C. Sono stati aggiunti 0,5 ml dell'inoculo fungicida normalizzato in ciascun tubo, mescolando bene. Dopo 10 minuti di contatto a 20 ±2 °C, una provetta è stata prelevata con una pinza microbiologica da 4 mm di larghezza e trasferita in 10 ml di neutralizzante appropriato. La procedura è stata ripetuta per tutti i tubi. Sono stati effettuati controlli come descritto nella metodologia ufficiale AOAC 955.17 “Fungicidal Activity of Disinfectants”. Dopo ogni trasferimento, i tubi sono stati agitati accuratamente e incubati a 25–30 °C per 7-10 giorni. Dopo l'incubazione, sono stati verificati eventuali segni di crescita.

Metodo “Tempo di inattività”

Preparazione dei microrganismi di prova. Una coltura di Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 è stata coltivata su Sabouraud Dextrose Agar (SDA) per 7-10 giorni a 25–30 °C. Il mezzo di coltura è stato preparato sciogliendo le colonie di micelio dalla superficie dell'agar e ammorbidendole con soluzione salina in un trituratore di tessuti sterile. 

Procedura di prova. Sono stati prelevati 0,1 ml del mezzo di coltura e aggiunti a 9,9 ml del disinfettante. Dopo tempi di contatto di 1, 5 e 10 minuti, sono state prelevate 0,1 ml dal tubo e trasferite in 10 ml di neutralizzante. Sono state preparate diluizioni decimali seriali, piattate e distribuite su SDA. Le piastre sono state incubate a 30 °C per 5–7 giorni. I controlli sono stati eseguiti nello stesso modo, ma utilizzando un tampone invece del disinfettante. I valori log10 di UFC/ml sono stati calcolati per i controlli e i campioni di prova. I valori di riduzione log10 rappresentano la differenza tra i valori medi di controllo e quelli dei campioni di prova.

METODO “Tempo di inattività”