Fungicidewerking van wereldwijd geaccepteerde kwartair ammonium-desinfectiemiddelen

Tabel I

Figuur 1

Tabel II

Tabel III

Tabel IV

Tabel V

Figuur 2

ABSTRACT

Vierfach ammoniumverbundene Verbindungen (QAV) sind hervorragende Wirkstoffe in Produkten zur Desinfektion, da sie eine geringe Toxizität, eine gute Reinigungsaktivität und eine bakterizide Wirksamkeit aufweisen. Leider sind viele der heute auf dem Markt erhältlichen QAV-Produkte unverträglich mit einigen Sterilisationsmethoden und zeigen eine unzureichende fungizide Wirkung. Diese Nachteile können dazu führen, dass der Einsatz von QAV-Desinfektionsmitteln in Reinräumen nach ISO-5 vermieden wird. Außerdem werden einige QAV in manchen europäischen Ländern nur eingeschränkt bei Behörden akzeptiert. Die hier beschriebenen Studien belegen, dass ein Produkt, das Didecyldimethylammoniumchlorid (einer QAV) enthält, Wirkung gegen Pilzgenotypen, z. B. Aspergillus brasiliensis, aufweist, unter Bestrahlung stabil ist und weltweite Normen zur Umweltverträglichkeit erfüllt.

EINFÜHRUNG

Vierfach ammoniumverbindungen wurden seit den 1930er Jahren als Wirkstoffe in Desinfektionsmitteln für harte Oberflächen eingesetzt, und mittlerweile sind Hunderte von Varianten erhältlich. Diese Verbindungen sind folgendermaßen aufgebaut: Um ein positiv geladenes Stickstoffatom gruppieren sich vier organische Gruppen (1). Im Laufe der Jahre wurden verschiedene QAV entwickelt, die alle unterschiedliche Kombinationen von an das Stickstoffatom gebundenen Alkyl- und aromatischen Gruppen aufweisen. Diese Rezepturen werden heute weltweit verwendet (2).

Ein wichtiger Faktor bei der Auswahl einer QAV für eine Desinfektionsmittelrezeptur ist die Akzeptanz durch die entsprechenden Kontrollorgane, z. B. die United States Environmental Protection Agency (EPA) und die Richtlinie des Europäischen Parlaments über das Inverkehrbringen von Biozid-Produkten (Biozid-Richtlinie). Die Anzahl der bei der EPA registrierten QAV, die in der Biozid-Richtlinie aktiv unterstützt werden, ist relativ gering. Dazu zählen nur die Wirkstoffe Didecyldimethylammoniumchlorid und Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (3,4). Dies kann die Auswahl eines quartären Ammonium-Desinfektionsmittels für internationale Pharmaunternehmen erschweren, die an der Vereinheitlichung global geltender Arbeitsvorschriften interessiert sind. Diese Herausforderung wird noch größer, wenn es darum geht, ein Desinfektionsmittel für den Einsatz in einer kontrollierten Umgebung auszuwählen.

Produkte zur Desinfektion müssen vor ihrem Einsatz im Reinraum sterilisiert werden (5). Eine Methode zur Sterilisation des Produkts und seiner Verpackung ist die Bestrahlung mit Gammastrahlen. QAV mit Alkylgruppen haben nachgewiesen, dass sie bei Gammabestrahlung eine bessere Stabilität aufweisen als QAV mit aromatischen Gruppen. Wird eine aromatische QAV der Gammabestrahlung ausgesetzt, kann sich die Bindung zwischen dem Stickstoffatom um den aromatischen Teil des Moleküls lösen, wodurch Nebenprodukte wie Amine entstehen können. Tabelle I vergleicht die Stabilität einer aromatischen QAV-Rezeptur unter Gammabestrahlung mit der Stabilität einer Alkyl-QAV-Rezeptur. Die Zersetzung der Alkyl-QAV durch Gamma-Strahlen ist minimal, während die Zersetzung der aromatischen QAV erheblich ist und mit zunehmender Bestrahlungsdosis zunimmt (6). (Siehe Tab. I)

Bei der Abwägung der regulatorischen Kriterien gegen die gewünschte Bestrahlungsstabilität ist Didecyldimethylammoniumchlorid die beste Wahl unter allen verbleibenden QAV, die für eine weltweit einsetzbare Desinfektionsmittelrezeptur in Frage kommen. (Siehe Abb. 1)

Obwohl Didecyldimethylammoniumchlorid die Anforderungen für eine weltweite Verwendung erfüllt, fehlt es einigen QAV-Rezepturen an einem breiten Wirkungsspektrum. Einerseits zeigen einige QAV-Produkte bakterizide und viruzide Wirkung, andererseits fehlt ihnen die erforderliche Wirksamkeit gegen bestimmte Pilzarten aufgrund verschiedener Mechanismen der spezifischen Resistenz und der Beschaffenheit von Pilzsporen, die widerstandsfähiger gegen Desinfektion sind (7). Die Folgen eines Pilzbefalls können erheblich sein und zu langfristigen Problemen im Betrieb führen. In Warnschreiben und Mängelberichten (Formular 483) der FDA (Food and Drug Administration) werden häufig unzureichende Maßnahmen gegen Pilzbefall und das Fehlen der Gewähr auf Wirksamkeit der in einer Einrichtung verwendeten Desinfektionsmittel gegen Pilze aufgeführt (8,9).

Ein bestimmter Pilzgenotyp, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (früher bekannt als Aspergillus niger ATCC 16404), stellt eine schwierige Herausforderung für Pharmaunternehmen dar und wird von den meisten QAV-basierten Desinfektionsmitteln nicht erreicht (10). In vielen Fällen werden Sporizide und Desinfektionsmittel wie Bleichmittel (Natriumhypochlorit), Wasserstoffperoxid, Peressigsäure, Chlordioxid, Ozon, Glutaraldehyd, Iod und Phenole in Anwendungen eingesetzt, bei denen Wirksamkeit gegen Aspergillus brasiliensis gefordert ist. Der Einsatz einiger dieser Verbindungen kann jedoch Sicherheits-, Umwelt-, Geruchs- oder Verfärbungsprobleme mit sich bringen. Ein QAV-basiertes Desinfektionsmittel mit anerkannten Wirkungsnachweisen gegen Aspergillus brasiliensis stellt eine sichere Alternative für diesen Anwendungsbereich dar.

Bei der Rezeptur eines QAV-basierten Desinfektionsmittels können Inhaltsstoffe wie eine Alkaliquelle, ein Komplexbildner, ein Zusatzlösungsmittel oder ein Tensid ausgewählt werden, um die Wirkung einer auf Didecyldimethylammoniumchlorid basierenden Rezeptur zu verbessern. Diese Inhaltsstoffe erfüllen auch die Bedingungen der REACh-Verordnung (REACh steht für Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals, also für die Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung von Chemikalien) (11). Die Einhaltung dieser Verordnung ist für alle in der Europäischen Union vertriebenen Rezepturen obligatorisch.

Die in diesem Artikel beschriebenen Tests wurden an einer Rezeptur durchgeführt, die auf Didecyldimethylammoniumchlorid basiert. Dabei wurde die Rezeptur gegen verschiedene Pilzgenotypen unter Anwendung von europäischen und US-amerikanischen, von der EPA zugelassenen Methodiken getestet.

Materialien und Methoden

Für Wirksamkeitstests zu den Etikettaussagen von US-amerikanischen bzw. europäischen Desinfektionsmitteln ist eine strikte Einhaltung der entsprechenden Standardmethoden erforderlich, die von den zuständigen Behörden anerkannt werden. Die Verfahren werden wie folgt zusammengefasst.

BS EN 1650-Methode (12)

Zubereitung der Testkeime. Es wurden Suspensionslösungen von Candida albicans ATCC 10231 und Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 hergestellt, so dass sie ca. 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml ergeben. Es wurden serielle zehnfache Verdünnungen angefertigt, um die Anzahl der KBE (koloniebildende Einheiten) pro ml in der Inokulumsuspension zu verifizieren.

Testverfahren. Ein Aliquot des Desinfektionsmittels, das in hartem Wasser mit 300 ppm Calciumcarbonat (CaCO3) verdünnt wurde, wurde in ein Röhrchen gegeben, das die Störsubstanz und eine fungizide Suspension enthielt, und bei 20 ±1 °C für die angegebene Kontaktzeit im Röhrchen belassen. Nach Ablauf der Kontaktzeit wurde 1,0 ml der Testmischung in die Neutralisationslösung gegeben. Nach einer Neutralisationszeit von 5 Minuten ±10 Sekunden wurde eine 1,0-ml-Probe jeder neutralisierten Mischung auf eine sterile Petrischale gegeben. Geschmolztes Malzextrakt-Agar (MEA) wurde auf jede Petrischale verteilt. Nach der Inkubation wurden alle Platten gezählt und der KBE/ml-Wert der Testmischung berechnet. Während des in BS EN 1650 beschriebenen Testverfahrens erfolgten gleichzeitig Validierungen und Kontrollen.

BS EN 13697-Methode (13)

Zubereitung der Testkeime. Es wurden Suspensionslösungen von Candida albicans ATCC 10231 und Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 hergestellt, so dass sie ca. 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml ergeben. Es wurden serielle zehnfache Verdünnungen angefertigt, um die Anzahl der KBE pro ml in der Testsuspension zu verifizieren. Das Testinokulum wurde zubereitet, indem 1 ml jeder fungiziden Suspension zu 1 ml der Störsubstanz (3,0 g BSA in 1 Liter destilliertem Wasser) gegeben und gut durchgemischt wurde.

Testverfahren. Saubere, trockene Edelstahlscheiben mit einem Durchmesser von zwei Zentimetern wurden in flache, sterile Einzelbehälter platziert. Die Testoberfläche wurde mit 0,05 ml des zubereiteten Testinokulums beimpft und bei 37 °C getrocknet, bis sie sichtbar trocken war. Ein Aliquot der Desinfektionsmittellösung wurde auf jede Testoberfläche aufgebracht. Dabei wurde sichergestellt, dass das getrocknete Inokulum vollständig bedeckt war. Nach der festgelegten Einwirkzeit (5 min für C. albicans und 15 min für A. brasiliensis) wurden 10 ml der Neutralisationslösung hinzugefügt. Jeder Behälter wurde abgedeckt und 1 Minute lang gemischt, um alle verbleibenden Zellen/Sporen von den Oberflächen zu entfernen. Nach einer Neutralisationszeit von 5 min ±10 s wurde die neutralisierte Mischung seriell verdünnt, und eine 1,0-ml-Probe jeder Verdünnung wurde in doppelte sterile Petrischalen gegeben. Anschließend wurde die geschmolzene MEA hinzugefügt. Die Testoberfläche wurde herausgenommen, mit 10 ml destilliertem Wasser abgespült und mit der Testseite nach oben auf eine Petrischal gelegt, auf der sich ca. 10 ml des verfestigten MEA befanden. Ein Aliquot des sterilen, destillierten Wassers wurde auf die Scheibe gegeben, und die Oberfläche wurde mit einem sterilen Spachtel 1 Minute lang abgeschabt, um Rückstände des getrockneten Inokulums von der Oberfläche der Platte zu entfernen. Weitere 10 ml der geschmolzenen MEA wurden über die Scheibe gegossen. Nach der Inkubation wurden alle Platten gezählt und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten notiert. Während des in BS EN 13697:2001 beschriebenen Testverfahrens erfolgten gleichzeitig Validierungs- und Kontrolltests.

Fungizide Methodik nach AOAC (14)

Zubereitung der Testkeime. Pilzkulturen von Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 und Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 wurden in Neopepton-Glucose-Agar (NGA) bei 25–30 °C über 7 bis 10 Tage vermehrt. Die Myzelmatten wurden von der Agaroberfläche gelöst und mit Kochsalzlösung in einem sterilen Gewebezerkleinerer aufgeweicht. Anschließend erfolgte eine Filtration über sterile Glaswolle. Die endgültigen Inokula wurden durch Zugabe der entsprechenden Menge an Fetal Bovine Serum (FBS) zu jeder Kultur zubereitet, um eine 5-prozentige Mischung zu erhalten. Die Dichte jeder Konidiensuspension wurde mittels Plattenzählverfahren ermittelt. Vor Gebrauch wurden die jeweiligen Suspensionslösungen mit Kochsalzlösung normiert, sodass etwa 5,0 x 10^6 Konidien/ml produziert wurden.

Testverfahren. Für jeden Testkeim wurden zwei 25 x 150 mm große Reagenzgläser mit jeweils 5 ml Inhalt, die jede Charge der Testsubstanzen repräsentierten, auf 20 ±2 °C eingestellt. Eine Menge von 0,5 ml des normierten, filamentösen fungiziden Inokulums wurde jedem Röhrchen beigegeben und geschwenkt. Nach einer Kontaktzeit von 10 Minuten bei 20 ±2 °C wurde eine Probe aus dem Röhrchen mit einer 4 mm breiten mikrobiologischen Schlinge in 10 ml des entsprechenden Neutralisiermittels überführt. Der Vorgang wurde für alle Röhrchen wiederholt. Entsprechende Kontrollen wurden gemäß der offiziellen AOAC-Methode 955.17 „Fungicidal Activity of Disinfectants“ durchgeführt. Nach jedem Transfer wurden die Röhrchen gründlich geschüttelt und 7 bis 10 Tage bei 25–30 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen auf das Vorhandensein oder Fehlen von Wachstum geprüft.

Methode „Abtötungszeit“

Zubereitung der Testkeime. Eine Pilzkultur von Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 wurde auf einem Sabouraud-Dextrose-Schrägagar (SDA) 7 bis 10 Tage bei 25–30 °C gezüchtet. Das Mikroben-Arbeitsnährmedium wurde hergestellt, indem die Myzelmatten von der Agaroberfläche gelöst und mit Kochsalzlösung in einem sterilen Gewebezerkleinerer aufgeweicht wurden. 

Testverfahren. Eine Menge von 0,1 ml des Arbeitsnährmediums wurde in 9,9 ml des Desinfektionsmittels gegeben. Nach Kontaktzeiten von 1, 5 und 10 Minuten wurde eine 0,1-ml-Probe aus dem Röhrchen in 10 ml der Neutralisationslösung überführt. Anschließend wurden serielle zehnfache Verdünnungen hergestellt, auf Platten ausgesät und mit SDA begossen. Die Platten wurden 5–7 Tage bei 30 °C inkubiert. Die Kontrollen wurden auf gleiche Weise durchgeführt, allerdings wurde anstelle des Desinfektionsmittels ein Puffer verwendet. Die log10-Werte der KBE/ml-Daten wurden für Kontrollen und Testproben berechnet. Die log10-Reduktionswerte stellen die Differenz zwischen den mittleren log10-Kontrollwerten und den log10-Werten der Testproben dar.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Der BS EN 1650 ist ein quantitativer Suspensions-Test, der zur Beurteilung der fungiziden Wirkung von Desinfektionsmitteln verwendet wird. Da die Testbedingungen repräsentativ für den praktischen Gebrauch sind, kann diese Methode für generische Wirkungsaussagen zu Desinfektionsmitteln in vielen europäischen Ländern genutzt werden. Das Zulässigkeitskriterium für den Test beträgt ≥ 4 log10 Reduktion der lebenden Keimzahlen (Log R). Tabelle II zeigt, dass das in hartem Wasser mit einem Verhältnis von 1:128 verdünnte und unter verschmutzten Bedingungen bei 20 ±1 °C getestete Produkt einen Log R über 4,5 erreichte und somit eine fungizide Wirkung gegen Candida albicans ATCC 10231 über 5 Minuten nachwies. Tabelle III zeigt, dass das in hartem Wasser mit einem Verhältnis von 1:32 verdünnte und unter verschmutzten Bedingungen bei 20 ±1 °C getestete Produkt einen Log R über 4,6 erreichte und somit eine fungizide Wirkung gegen Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 über 15 Minuten nachwies.

Der BS EN 13697 ist ein quantitativer Oberflächentest, der nachweist, dass Produkte eine mikrobizide Wirkung gegen Mikroorganismen haben, die sich an Oberflächen anheften. Das Zulässigkeitskriterium für fungizide Wirkung beträgt ≥ 3 log10 Reduktion; der Wert wird als mikrobizide Wirkung (ME-Wert) berechnet. Tabelle IV zeigt, dass das in hartem Wasser mit einem Verhältnis von 1:128 verdünnte und unter schmutzigen Bedingungen (3 g/l BSA) bei 20 ±1 °C getestete Produkt einen ME-Wert über 5,66 erreichte und somit eine fungizide Wirkung gegen Candida albicans ATCC 10231 über 15 Minuten nachwies. 

In Tabelle V wird gezeigt, dass das in hartem Wasser mit einem Verhältnis von 1:32 verdünnte und unter verschmutzten Bedingungen (3 g/l BSA) bei 20 ±1 °C getestete Produkt einen ME-Wert über 5,66 erreichte und somit eine fungizide Wirkung gegen Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 über 15 Minuten nachwies.

In den USA wird die fungizide Wirkung mit der offiziellen AOAC-Methode 955.17 „Fungicidal Activity of Disinfectants“ ermittelt. Ergebnisse zeigten, dass das Testprodukt nach einer Einwirkzeit von 10 Minuten wirksam gegen Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 und Aspergillus niger ATCC 6275 war, wenn es im Verhältnis 1:128 in 400 ppm hartem Wasser verdünnt wurde und in Anwesenheit einer organischen Belastung durch 5-prozentiges Fetal Bovine Serum (FBS) mittels AOAC-Test auf fungizide Wirkung ohne beobachtetes Wachstum getestet wurde. Das Produkt zeigte außerdem Wirksamkeit nach 10 Minuten gegen Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, wenn es im Verhältnis 1:64 in 400 ppm hartem Wasser verdünnt wurde und in Anwesenheit von 5-prozentigem Fetal Bovine Serum (FBS). Studien haben gezeigt, dass Trichophyton mentagrophytes stärker auf das Desinfektionsmittel reagiert als Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (15). 

Die Grundwirkung von QAV-haltigen Produkten auf Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 kann mittels eines Abtötungszeit-Suspensionstests ermittelt werden, wie in Abbildung II dargestellt. Die Produkte A und B sind einsatzbereite Haushaltsreiniger (QAV-Reiniger/-Desinfektionsmittel), während die Produkte C, D, E und F QAV-Desinfektionsmittel für den pharmazeutischen Bedarf sind. Produkt C enthält außerdem ein Biguanid. 

Die Ergebnisse in Abbildung II belegen die Bedeutung einer ordnungsgemäßen Rezeptur bei der Entwicklung von QAV-Desinfektionsmitteln. Ein signifikanter Unterschied in der Wirksamkeit gegen Aspergillus brasiliensis kann festgestellt werden, wobei diese nicht direkt mit dem Wirkstofftyp, der Konzentration oder der praktischen Anwendung korreliert.

Schlussbemerkung

Der Einsatz eines Desinfektionsmittels, das auf einer quartären Ammoniumverbindung basiert, bringt mehrere Vorteile mit sich. Dazu zählen die hervorragende Reinigungsaktivität, die geringe Toxizität sowie bakterizide und viruzide Wirksamkeit. Allerdings bieten nicht alle Rezepturen mit quartären Ammoniumverbindungen die fungizide Wirkung anderer Wirkstoffe, und die auf dem Markt erhältlichen QAV können sehr unterschiedliche Entwicklungsstände hinsichtlich der Wirkung gegen Pilzsporen aufweisen. Ein richtig formuliertes QAV-basiertes Desinfektionsmittel kann jedoch eine Wirkung gegen anspruchsvolle Pilzarten wie Aspergillus brasiliensis entfalten, ohne bei anderen wichtigen Eigenschaften wie den weltweit anerkannten Inhaltsstoffen, Umweltverträglichkeit und Bestrahlungsstabilität in konzentrierter Form Kompromisse eingehen zu müssen.

Literaturhinweise

1. M. Cucci. Soap and Sanitary Chemicals. 25, 129-134,145 (1949). 

2. P. Schaeufele. J. Assoc. Ocs. 61, 387-389 (1984). 

3. U. S. Environmental Protection Agency, Substance Registry Services, http://iaspub.epa.gov/sor_internet/registry/substreg/searchandretrieve/substancesearch/search.do, Zugriff am 13. Juli 2011. 

4. Verordnung (EG) Nr. 2032/2003. Liste der Teilnehmer/Antragsteller am Überprüfungsprogramm für bestehende aktive Substanzen in Biozid-Produkten, http://ec.europa.eu/environment/biocides/pdf/list_participants_applicants_subs.pdf, Zugriff am 13. Juli 2011. 

5. FDA Guidance for Industry, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing – Current Good Manufacturing Practice, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, September 2004. 

6. Interne Daten der STERIS Corporation, unveröffentlicht. 

7. McDonnell, G.E. „Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance,“ ASM Press, Washington, DC, 2007. 

8. U.S. Food and Drug Administration, Inspections, Compliance, Enforcement, and Criminal Investigations, Medimmune, Inc. Warning Letter, 27. Mai 2007, http://www.fda.gov/ICECI/EnforcementActions/WarningLetters/2007/ucm076398.htm, Zugriff am 9. Mai 2011. 

9. GMP Trends Inc., Issue 766, 15. Dezember 2008. 

10. Polarine, J., Macauley, J., Karanja, P., Klein, D., Martin, A., „Evaluating the Activity of Disinfectants Against Fungi,“ Cleanrooms: The Magazine of Contamination Control Technology, 23 (2), Februar 2009. 

11. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 18. Dezember 2006 über die Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), mit Einrichtung einer Europäischen Chemikalienagentur, Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und Aufhebung der Verordnung (EEC) Nr. 793/93 sowie der Verordnung (EG) Nr. 1488/94, sowie der Richtlinie 76/769/EWG des Rates und der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission, http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32006R1907:EN:NOT, Zugriff am 11. Juli 2011. 

12. BS EN 1650:2008. Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika – Quantitativer Suspensionstest zur Bewertung der fungiziden Aktivität chemischer Desinfektionsmittel und Antiseptika, die in der Lebensmittel-, Industrie-, Haushalts- und Institutionenbereich verwendet werden (Phase 2, Schritt 1). Erhältlich beim British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., London W4 4AL, Großbritannien, http://www.bsi-global.com. 

13. BS EN 13697:2001. Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika – Quantitativer nicht-poröser Oberflächentest zur Bewertung der bakteriziden und/oder fungiziden Aktivität chemischer Desinfektionsmittel in lebensmittel-, industrie-, haushalts- und institutionellen Bereichen – Prüfverfahren und Anforderungen ohne mechanische Einwirkung (Phase 2/Schritt 2). Erhältlich beim British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., London W4 4AL, Großbritannien, http://www.bsi-global.com. 

14. AOAC Offizielle Methode 955.17 „Fungicidal Activity of Disinfectants“, Offizielle Methoden der AOAC, Achte Ausgabe, AOAC International, 2005. 

15. Interne Daten der STERIS Corporation, unveröffentlicht.