A világon elfogadott negyedéves ammóniumos fertőtlenítőszerek fungicid hatása

Táblázat I

Ábra 1

Táblázat II

Táblázat III

Táblázat IV

Táblázat V

Ábra 2

ÖSSZEFOGLALÓ

Negyedéves ammóniumsók (QAV) kiváló hatóanyagok fertőtlenítő termékekben, mivel alacsony toxicitással, jó tisztítóhatással és baktericid hatékonysággal rendelkeznek. Sajnos a mai piacon elérhető QAV-termékek közül sok nem kompatibilis bizonyos sterilizálási módszerekkel, és nem felel meg a megfelelő gombásodás elleni hatásnak. Ezek a hátrányok vezethetnek ahhoz, hogy a QAV-alapú fertőtlenítőszerek alkalmazását ISO-5 tisztatérben elkerüljék. Emellett néhány QAV-t egyes európai országokban csak korlátozottan fogadnak el hatóságok. Az itt bemutatott tanulmányok igazolják, hogy egy, a Didecyldimethylammoniumchlorid (egy QAV) tartalmazó termék hatékony a gombatörzsek, például Aspergillus brasiliensis ellen, stabil a sugárzás hatására, és megfelel a globális környezetvédelmi normáknak.

BEVEZETÉS

A negyedéves ammóniumsók hatóanyagként történő alkalmazása a kemény felületek fertőtlenítésében a 30-as évek óta ismert, és mára több száz változatuk elérhető. Ezek a vegyületek így épülnek fel: egy pozitív töltésű nitrogénatom körül négy szerves csoport helyezkedik el (1). Az évek során különböző QAV-kat fejlesztettek ki, amelyek mind különböző alkil- és aromás csoportokat tartalmaznak a nitrogénatomhoz kötötten. Ezek a formulák ma világszerte használatban vannak (2).

Az egyik fontos tényező, amely befolyásolja egy QAV kiválasztását egy fertőtlenítőszer formulájában, a megfelelő hatósági elfogadás kérdése, például az Amerikai Környezetvédelmi Hivatal (EPA) vagy az Európai Parlament irányelve a biocid termékek forgalomba hozataláról (Biozid irányelv). Az EPA által regisztrált és a Biozid irányelv által támogatott QAV-k száma viszonylag alacsony, csak a Didecyldimethylammoniumchlorid és az Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid hatóanyagok tartoznak ide (3,4). Ez megnehezítheti a nemzetközi gyógyszergyártók számára a globálisan egységes szabályozási keretek kialakítását, különösen akkor, ha fertőtlenítőszert kell kiválasztani kontrollált környezetben történő alkalmazásra.

A fertőtlenítő termékeket sterilizálni kell a tisztatérben való alkalmazás előtt (5). Egy módszer a termék és csomagolásának sterilizálására a gamma-sugárzásnak való kitettség. Az alkilcsoportokat tartalmazó QAV-k bizonyítottan stabilabbak gamma-sugárzás esetén, mint az aromás csoportokat tartalmazó QAV-k. Aromás QAV-k gamma-sugárzásnak való kitettség esetén a kötés a nitrogénatom és az aromás rész között meglazulhat, ami melléktermékként aminok képződéséhez vezethet. Az I. táblázatban összehasonlítjuk egy aromás QAV formulájának gamma-sugárzással szembeni stabilitását egy alkil QAV formulájával. Az alkil QAV-k bomlása minimális a gamma-sugárzás hatására, míg az aromás QAV-k bomlása jelentős, és a dózis növekedésével nő (6). (Lásd: Tábla I)

A szabályozási követelmények és a kívánt gamma-stabilitás mérlegelése során a Didecyldimethylammoniumchlorid a legjobb választás minden, globálisan alkalmazható fertőtlenítőszer formulájához, amely még megfelel a környezetvédelmi normáknak is. (Lásd: Ábra 1)

Bár a Didecyldimethylammoniumchlorid megfelel a globális alkalmazás követelményeinek, néhány QAV formulának nem elég széles a hatás-spektruma. Egyfelől bizonyos QAV-termékek baktericid és virucid hatékonyságot mutatnak, másfelől azonban nem rendelkeznek a megfelelő hatékonysággal bizonyos gombafajok ellen, különböző rezisztencia mechanizmusok és a spórák ellenálló képessége miatt (7). A gombás fertőzés következményei súlyosak lehetnek, hosszú távú problémákat okozva a működésben. Az FDA (Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság) figyelmeztető leveleiben és hiányossági jelentéseiben (Form 483) gyakran szerepel, hogy nem alkalmaznak megfelelő intézkedéseket a gombás fertőzések ellen, illetve hiányzik a garancia arra, hogy a használt fertőtlenítőszerek hatékonyak a gombák ellen (8,9).

Egy adott gombatörzs, az Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (korábban Aspergillus niger ATCC 16404 néven ismert), nehéz kihívást jelent a gyógyszergyártók számára, és a legtöbb QAV-alapú fertőtlenítőszer nem éri el a hatékonyságot (10). Számos esetben spóricid szerek és olyan fertőtlenítőszerek használatosak, mint a fehérítő (nátrium-hipoklorit), hidrogén-peroxid, peressav, klór-dioxid, ózon, glutaraldehid, jód és fenolok, különösen akkor, ha hatékonyságukat Aspergillus brasiliensis ellen kell bizonyítani. Azonban néhány ezek közül biztonsági, környezeti, szag- vagy színezési problémákat okozhat. Egy, az Aspergillus brasiliensis ellen hatékony, elismert hatóanyagokat tartalmazó QAV-alapú fertőtlenítőszer biztonságos alternatívát jelenthet ezen alkalmazási területen.

A QAV-alapú fertőtlenítőszer formulázásakor olyan összetevőket lehet választani, mint például alkáli forrás, komplexképző, adalékoldószer vagy tensid, hogy javítsák a Didecyldimethylammoniumchlorid alapú formulák hatékonyságát. Ezek az összetevők megfelelnek a REACh-rendelet (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals – Vegyi anyagok regisztrációja, értékelése, engedélyezése és korlátozása) feltételeinek (11). Ennek a rendeletnek való megfelelés kötelező minden Európai Unióban forgalmazott formulára.

Ebben a cikkben ismertetett teszteket egy, a Didecyldimethylammoniumchloridra alapozott formulán végeztük, melyet különböző gombatörzsek ellen teszteltünk európai és amerikai, az EPA által jóváhagyott módszerek alkalmazásával.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A US és európai fertőtlenítőszerek hatékonysági tesztjeihez szigorúan be kell tartani az illetékes hatóságok által elismert standard módszereket. Az eljárásokat az alábbiakban foglaljuk össze.

BS EN 1650-módszer (12)

A tesztmikroorganizmusok elkészítése. Candida albicans ATCC 10231 és Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 szuszpenziókat készítettünk, úgy, hogy kb. 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml eredményt érjenek el. Sorozatos tízszeres hígításokat készítettünk, hogy ellenőrizzük a kolóniatermelő egységek (KBE) számát az inokulációs szuszpenzióban.

Tesztelési eljárás. Egy adag, kemény vízben, 300 ppm kalcium-karbonáttal (CaCO3) hígított fertőtlenítőszer kerül egy csőbe, amelyben a zavaró anyag és egy fungicid szuszpenzió található, és 20 ±1 °C-on a megadott kontaktidő alatt hagyjuk. A kontaktidő letelte után 1,0 ml a tesztkeverékből a neutralizáló oldatba kerül. A neutralizálási idő 5 perc ±10 másodperc. Ezután minden neutralizált keverékből 1,0 ml-t teszünk steril Petri-csészébe. Megolvasztott malátaextrakt-agar (MEA) kerül minden csészébe. Inkubálás után minden tányért megszámolunk, és kiszámítjuk a KBE/ml értéket. A BS EN 1650 szerinti teszt során egyidejűleg érvényesítést és kontrollokat végeztünk.

BS EN 13697-módszer (13)

A tesztmikroorganizmusok elkészítése. Candida albicans ATCC 10231 és Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 szuszpenziókat készítettünk, úgy, hogy kb. 1,5–5,0 x 10^7 KbE/ml eredményt érjenek el. Sorozatos tízszeres hígításokat készítettünk, hogy ellenőrizzük a kolóniatermelő egységek számát az inokulumban. A tesztinokulumot úgy készítettük, hogy 1 ml fungicid szuszpenziót 1 ml zavaró anyaghoz (3,0 g BSA 1 liter desztillált vízben) adtunk, és jól összekevertük.

Tesztelési eljárás. Tiszta, száraz, két centiméter átmérőjű rozsdamentes acéllemezeket helyeztünk lapos, steril tartályokba. A tesztfelületet 0,05 ml a készített inokulumból befecskendeztük, és 37 °C-on szárítottuk, amíg láthatóan száraz nem lett. Egy adag fertőtlenítőszer-oldatot helyeztünk minden tesztfelületre, ügyelve arra, hogy a száraz inokulum teljes mértékben fedve legyen. A megadott hatóidő (5 perc C. albicans esetén, 15 perc A. brasiliensis esetén) után 10 ml neutralizáló oldatot adtunk hozzá. Minden tartályt lefedtünk, és 1 percig kevertük, hogy minden maradék sejt/spóra leváljon a felületekről. A neutralizálási idő 5 perc ±10 másodperc volt, majd a neutralizált keveréket sorozatosan hígítottuk, és minden hígításból 1,0 ml-t két példányban steril Petri-csészébe helyeztünk. Ezután hozzáadtuk az olvasztott MEA-t. A tesztfelületet kivettük, 10 ml desztillált vízzel leöblítettük, és felhelyeztük egy Petri-csészére, amelyben kb. 10 ml megszilárdult MEA volt. Egy adag steril, desztillált víz kerül a lemezre, majd steril spatulával 1 percig dörzsöljük, hogy eltávolítsuk a száraz inokulum maradványait. További 10 ml olvasztott MEA-t öntöttünk a lemezre. Inkubálás után minden tányért kivettünk, és a kolóniák számát feljegyeztük. A BS EN 13697:2001 szerinti teszt során egyidejűleg érvényesítést és kontrollokat végeztünk.

AOAC módszer a fungicid hatékonyság mérésére (14)

A tesztmikroorganizmusok elkészítése. Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 és Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 gombatenyészeteket Neopepton-glükóz agaron (NGA) tenyésztettünk 25–30 °C-on 7-10 napig. A myceliumokat az agar felszínéről levágtuk, sóoldattal steril üvegszövet-zúzóban felaprítottuk, majd szűrőn át szűrtük steril üveggyapot segítségével. A végső inokulumokat a megfelelő mennyiségű vetélőborjú-szérummal (FBS) készítettük, hogy 5%-os keveréket kapjunk. A konidium-szuszpenzió sűrűségét tenyésztési módszerrel határoztuk meg. Felhasználás előtt a szuszpenziókat sóoldattal normáltuk, hogy kb. 5,0 x 10^6 konídium/ml legyen.

Tesztelési eljárás. Minden mikroorganizmus esetében két, 25 x 150 mm-es, 5 ml-es csőben készített próbát tartottunk, amelyek minden, a vizsgált anyagokat tartalmazó tételt reprezentáltak, 20 ±2 °C-on. 0,5 ml a standardizált, filamentózus fungicid inokulumból minden csőbe került, majd megkevertük. 10 perc kontaktidő után a csőből 4 mm széles mikrobiológiai csipesszel 10 ml neutralizáló oldatba szállítottuk a mintát. Ezt a folyamatot minden cső esetében megismételtük. Megfelelő kontrollokat is végeztünk az AOAC módszer 955.17 szerint, a fertőtlenítőszer helyett puffer oldatot használva. Minden cső tartalmát alaposan megráztuk, majd 7-10 napig inkubáltuk 25–30 °C-on. Az inkubálás után megvizsgáltuk, hogy van-e növekedés, vagy sem, és a KBE/ml értékeket kiszámítottuk. A log10 értékek a kontroll és a teszt eredményei között a különbséget jelentik, a log10-redukció pedig a középértékek különbsége.

„Eltávolítási idő” módszer

A tesztmikroorganizmusok elkészítése. Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 gombatenyészetet Sabouraud-dextróz agaron (SDA) 7–10 napig tenyésztettünk 25–30 °C-on. A mikrobnövekedést a agar felszínéről levágtuk, sóoldattal steril üvegszövet-zúzóban felaprítottuk, majd steril szűrőn át szűrtük.

Tesztelési eljárás. 0,1 ml munkakultúra kerül 9,9 ml fertőtlenítőszerbe. 1, 5 és 10 perc kontaktidő után 0,1 ml mintát veszünk a csőből, és 10 ml neutralizáló oldatba helyezzük. Ezután sorozatos tízszeres hígításokat készítünk, lemezre tesszük és SDA-val befedjük. A lemezeket 5–7 napig inkubáljuk 30 °C-on. A kontrollokat ugyanezen módon végezzük, de a fertőtlenítőszer helyett puffer oldatot használunk. A kontroll és a teszt eredményeiből kiszámítjuk a log10 értékeket, és a log10-redukció a két érték különbségét jelenti.

„Eltávolítási idő” módszer