Efecto fungicida de los desinfectantes de amonio cuaternario aceptados mundialmente

Tabla I

Figura 1

Tabla II

Tabla III

Tabla IV

Tabla V

Figura 2

RESUMEN

Las sustancias químicas de amonio cuaternario (QAV) son excelentes ingredientes activos en productos desinfectantes, ya que presentan baja toxicidad, buena actividad de limpieza y eficacia bactericida. Lamentablemente, muchos de los productos QAV disponibles en el mercado actual son incompatibles con algunos métodos de esterilización y muestran una eficacia fungicida insuficiente. Estas desventajas pueden llevar a evitar el uso de desinfectantes QAV en salas limpias según ISO-5. Además, algunos QAV solo son aceptados de manera limitada por las autoridades en ciertos países europeos. Los estudios aquí presentados demuestran que un producto que contiene cloruro de didecildimetilamonio (uno de los QAV) tiene actividad contra genotipos de hongos, como Aspergillus brasiliensis, es estable bajo radiación y cumple con normas ambientales internacionales.

INTRODUCCIÓN

Las sustancias químicas de amonio cuaternario se han utilizado como ingredientes activos en desinfectantes para superficies duras desde la década de 1930, y actualmente existen cientos de variantes disponibles. Estas sustancias están estructuradas de la siguiente manera: un átomo de nitrógeno cargado positivamente está unido a cuatro grupos orgánicos (1). A lo largo de los años, se han desarrollado diferentes QAV que contienen distintas combinaciones de grupos alquilo y aromáticos unidos al átomo de nitrógeno. Estas formulaciones se utilizan en todo el mundo (2).

Un factor importante que influye en la selección de un QAV para una formulación desinfectante es la aceptación por parte de los organismos reguladores correspondientes, como la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA) y la directiva del Parlamento Europeo sobre la comercialización de biocidas (Directiva de biocidas). El número de QAV registrados en la EPA y activamente respaldados por la Directiva de biocidas es relativamente pequeño. Solo se consideran los ingredientes activos como el cloruro de didecildimetilamonio y el cloruro de alquildimetilbencilamonio (3,4). Esto puede hacer que la elección de un desinfectante cuaternario sea una tarea difícil para las empresas farmacéuticas internacionales interesadas en la unificación de normativas globales. Este desafío se vuelve aún mayor cuando se trata de seleccionar un desinfectante para su uso en entornos controlados.

Los productos desinfectantes deben ser esterilizados antes de su uso en salas limpias (5). Un método de esterilización consiste en la irradiación con rayos gamma. Los QAV con grupos alquilo han demostrado tener mejor estabilidad frente a la radiación gamma en comparación con los QAV aromáticos. Cuando un QAV aromático se expone a la radiación gamma, puede disociarse la unión entre el nitrógeno y el resto del molécula, formando subproductos como aminas. La Tabla I compara la estabilidad de una formulación aromática de QAV bajo radiación gamma con la de una formulación alquilo. La descomposición de los QAV alquilo por radiación gamma es mínima, mientras que la de los aromáticos es significativa y aumenta con la dosis de radiación (6). (Ver Tabla I)

Al ponderar los criterios regulatorios frente a la estabilidad deseada bajo radiación, el cloruro de didecildimetilamonio es la mejor opción entre todos los QAV considerados para una formulación desinfectante de uso global. (Ver Figura 1)

Aunque el cloruro de didecildimetilamonio cumple con los requisitos para uso mundial, algunos QAV no tienen un amplio espectro de actividad. Por un lado, ciertos productos QAV demuestran actividad bactericida y virucida, pero por otro, carecen de eficacia contra algunos tipos de hongos debido a mecanismos de resistencia específicos y a la naturaleza de las esporas, que son más resistentes a la desinfección (7). Las consecuencias de una infestación fúngica pueden ser graves y causar problemas a largo plazo en una operación. En cartas de advertencia e informes de no conformidad (Formulario 483) de la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.), se listan con frecuencia medidas insuficientes contra la infestación fúngica y la falta de garantía de que los desinfectantes utilizados en una instalación sean efectivos contra los hongos (8,9).

Un genotipo fúngico específico, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (anteriormente conocido como Aspergillus niger ATCC 16404), ha representado un desafío difícil para las empresas farmacéuticas y la mayoría de los desinfectantes basados en QAV no logran alcanzarlo (10). En muchos casos, se emplean esporicidas y desinfectantes como blanqueador (hipoclorito de sodio), peróxido de hidrógeno, ácido peracético, dióxido de cloro, ozono, glutaraldehído, yodo y fenoles en aplicaciones que requieren eficacia contra Aspergillus brasiliensis. Sin embargo, el uso de algunas de estas sustancias puede presentar problemas de seguridad, ambientales, olor o de decoloración. Un desinfectante basado en QAV con declaraciones de eficacia reconocidas contra Aspergillus brasiliensis representa una alternativa segura para los usuarios en este ámbito.

En la formulación de un desinfectante basado en QAV, se pueden seleccionar ingredientes como una fuente alcalina, un quelante, un aditivo disolvente o un tensioactivo para mejorar la eficacia de una formulación basada en cloruro de didecildimetilamonio. Estos ingredientes también cumplen con las condiciones del Reglamento REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Productos Químicos) (11). El cumplimiento de esta normativa en todas las formulaciones comercializadas en la Unión Europea es obligatorio.

Las pruebas descritas en este artículo se realizaron en una formulación basada en cloruro de didecildimetilamonio, evaluada contra diferentes genotipos de hongos mediante metodologías aprobadas por las autoridades europeas y estadounidenses (EPA).

MATERIALES Y MÉTODOS

Para las pruebas de eficacia relacionadas con las declaraciones en las etiquetas de desinfectantes estadounidenses y europeos, es necesaria una estricta adherencia a los métodos estándar reconocidos por las autoridades competentes. Los procedimientos se resumen a continuación.

Método BS EN 1650 (12)

Preparación de los microorganismos de prueba. Se prepararon suspensiones de Candida albicans ATCC 10231 y Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 con una concentración de aproximadamente 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Se realizaron diluciones en serie de diez veces para verificar la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml en la suspensión de inóculo.

Procedimiento de prueba. Se tomó un alícuota del desinfectante diluido en agua dura con 300 ppm de carbonato de calcio (CaCO3), y se colocó en un tubo con la sustancia interferente y una suspensión fungicida, dejándolo en contacto a 20 ±1 °C durante el tiempo especificado. Tras el contacto, se añadieron 1,0 ml de la mezcla de prueba a la solución de neutralización. Después de 5 minutos ±10 segundos de neutralización, se colocó una muestra de 1,0 ml de cada mezcla neutralizada en una placa de Petri estéril, distribuyendo agar maltosa fundido (MEA) en cada placa. Tras incubar, se contaron las colonias y se calcularon los UFC/ml de la muestra de prueba. Durante la prueba según BS EN 1650, se realizaron validaciones y controles correspondientes.

Método BS EN 13697 (13)

Preparación de los microorganismos de prueba. Se prepararon suspensiones de Candida albicans ATCC 10231 y Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 con aproximadamente 1,5–5,0 x 10^7 UFC/ml. Se realizaron diluciones en serie de diez veces para verificar la cantidad de UFC/ml en la suspensión de prueba. La inoculación se preparó mezclando 1 ml de cada suspensión fungicida con 1 ml de la sustancia interferente (3,0 g de BSA en 1 litro de agua destilada) y mezclando bien.

Procedimiento de prueba. Se colocaron en placas de acero inoxidable limpias y secas discos de 2 cm de diámetro en recipientes estériles. Se aplicaron 0,05 ml del inóculo preparado sobre la superficie, que se dejó secar a 37 °C hasta estar visible y completamente seca. Luego, se colocó en cada superficie un alícuota del desinfectante, asegurando que cubriera completamente el inóculo seco. Tras los tiempos de contacto de 5 minutos para C. albicans y 15 minutos para A. brasiliensis, se añadieron 10 ml de solución de neutralización. Cada recipiente se cubrió y se agitó durante 1 minuto para eliminar células y esporas de las superficies. Tras 5 minutos ±10 segundos, la mezcla neutralizada se diluyó en serie y se sembraron 1,0 ml de cada dilución en placas de Petri estériles, cubriéndolas con agar maltosa fundido. La superficie de la placa se recuperó, enjuagándola con 10 ml de agua destilada y raspando con una espátula estéril durante 1 minuto para eliminar restos de inóculo seco. Luego, se vertieron 10 ml de agar fundido sobre la superficie y se incubaron las placas durante 5–7 días a 30 °C. Se registró el conteo de colonias formadoras de unidades. Durante la prueba según BS EN 13697:2001, se realizaron validaciones y controles simultáneamente.

Metodología fungicida según AOAC (14)

Preparación de los microorganismos de prueba. Se cultivaron hongos Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus niger ATCC 6275 y Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 en agar de glucosa de Neopepton (NGA) a 25–30 °C durante 7 a 10 días. Se disolvieron las láminas de micelio en solución salina con un homogeneizador estéril. Luego, se filtraron a través de algodón estéril. Los inóculos finales se prepararon añadiendo la cantidad adecuada de suero fetal bovino (FBS) a cada cultivo para obtener una mezcla al 5%. La densidad de cada suspensión de conidios se determinó mediante recuento en placa. Antes de usar, las suspensiones se normalizaron con solución salina para producir aproximadamente 5,0 x 10^6 conidios/ml.

Procedimiento de prueba. Para cada microorganismo, se colocaron en tubos de 25 x 150 mm, con 5 ml de contenido, las muestras de la sustancia en diferentes lotes, y se ajustaron a 20 ±2 °C. Se añadieron 0,5 ml del inóculo fungicida normalizado a cada tubo, agitando. Tras 10 minutos de contacto a 20 ±2 °C, se transfirieron 10 ml de la muestra a un medio de neutralización. Este proceso se repitió en todos los tubos. Se realizaron controles según la metodología oficial AOAC 955.17. Después de cada transferencia, los tubos se agitaron y se incubaron a 25–30 °C durante 7 a 10 días. Tras la incubación, se verificó la presencia o ausencia de crecimiento. Se calcularon los valores log10 de UFC/ml para controles y muestras, y las reducciones log10 representan la diferencia entre los valores medios de control y las muestras.

Método de "Tiempo de contacto"

Preparación de los microorganismos de prueba. Se cultivó Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 en medio de Sabouraud-Dextrosa (SDA) durante 7 a 10 días a 25–30 °C. El medio de trabajo se preparó disolviendo las láminas de micelio en solución salina estéril.

Procedimiento de prueba. Se mezclaron 0,1 ml del medio de trabajo con 9,9 ml del desinfectante. Tras tiempos de contacto de 1, 5 y 10 minutos, se transfirieron 0,1 ml a 10 ml de solución de neutralización, y se realizaron diluciones en serie, sembrando en placas con SDA, que se incubaron a 30 °C durante 5–7 días. Los controles se realizaron en las mismas condiciones, usando un buffer en lugar del desinfectante. Se calcularon los valores log10 de UFC/ml y las reducciones log10 como diferencia entre los controles y las muestras.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El método BS EN 1650 es una prueba de suspensión cuantitativa para evaluar la actividad fungicida de desinfectantes, representativa del uso práctico, y puede usarse para declaraciones genéricas en muchos países europeos. El criterio de aceptación requiere una reducción de ≥ 4 log10 en el conteo de microorganismos (Log R). La Tabla II muestra que el producto probado, diluido en agua dura en proporción 1:128 y sometido a condiciones contaminadas a 20 ±1 °C, alcanzó un Log R superior a 4,5, demostrando eficacia fungicida contra Candida albicans ATCC 10231 en más de 5 minutos. La Tabla III indica que un producto diluido en agua dura en proporción 1:32 y sometido a condiciones contaminadas a 20 ±1 °C logró un Log R superior a 4,6, demostrando eficacia contra Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 en más de 15 minutos.

El método BS EN 13697 es una prueba de superficie cuantitativa que verifica la capacidad de productos para tener efecto microbicida en superficies adherentes. El criterio de aceptación para actividad fungicida es una reducción ≥ 3 log10, calculada como valor ME. La Tabla IV muestra que un producto diluido en agua dura en proporción 1:128 y sometido a condiciones sucias (3 g/l BSA) a 20 ±1 °C alcanzó un valor ME superior a 5,66, demostrando eficacia fungicida contra Candida albicans ATCC 10231 en más de 15 minutos. La Tabla V indica que un producto diluido en agua dura en proporción 1:32 y sometido a condiciones contaminadas (3 g/l BSA) a 20 ±1 °C logró un valor ME superior a 5,66, demostrando eficacia contra Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 en más de 15 minutos.

En EE. UU., la eficacia fungicida se evalúa mediante el método oficial AOAC 955.17 "Actividad fungicida de los desinfectantes". Los resultados muestran que el producto probado, tras 10 minutos de contacto, fue efectivo contra Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 y Aspergillus niger ATCC 6275, cuando se diluyó en proporción 1:128 en 400 ppm de agua dura en presencia de una carga orgánica de 5% de suero fetal bovino (FBS), sin crecimiento en alguna réplica del test. Además, demostró eficacia tras 10 minutos contra Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, en proporción 1:64 en 400 ppm de agua dura y presencia de FBS. Los estudios indican que Trichophyton mentagrophytes responde más fuerte al desinfectante que Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (15).  

La acción básica de los productos con QAV sobre Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 puede determinarse mediante una prueba de suspensión de tiempo de inactivación, como muestra la Figura II. Los productos A y B son limpiadores domésticos listos para usar (QAV limpiador/desinfectante), mientras que los productos C, D, E y F son desinfectantes QAV para uso farmacéutico. El producto C también contiene una biguanida.  

Los resultados en la Figura II demuestran la importancia de una formulación adecuada en el desarrollo de desinfectantes QAV. Se puede observar una diferencia significativa en la eficacia contra Aspergillus brasiliensis, que no se correlaciona directamente con el tipo de ingrediente activo, la concentración o la aplicación práctica.  

CONCLUSIÓN

El uso de un desinfectante basado en una sustancia de amonio cuaternario ofrece varias ventajas, como excelente actividad de limpieza, baja toxicidad y eficacia bactericida y virucida. Sin embargo, no todos los formulados con QAV poseen la misma eficacia fungicida, y los productos disponibles en el mercado pueden tener diferentes grados de desarrollo en cuanto a su actividad contra esporas de hongos. Un desinfectante formulado correctamente con QAV puede ser efectivo contra hongos resistentes como Aspergillus brasiliensis, sin comprometer otras propiedades importantes, como la aceptación de ingredientes a nivel mundial, la compatibilidad ambiental y la estabilidad bajo radiación en forma concentrada.  

REFERENCIAS

1. M. Cucci. Soap and Sanitary Chemicals. 25, 129-134,145 (1949). 

2. P. Schaeufele. J. Assoc. Ocs. 61, 387-389 (1984). 

3. U. S. Environmental Protection Agency, Substance Registry Services, http://iaspub.epa.gov/sor_internet/registry/substreg/searchandretrieve/substancesearch/search.do, consultado el 13 de julio de 2011. 

4. Reglamento (CE) nº 2032/2003. Lista de participantes/solicitantes en el Programa de revisión de sustancias activas existentes en biocidas, http://ec.europa.eu/environment/biocides/pdf/list_participants_applicants_subs.pdf, consultado el 13 de julio de 2011. 

5. Guía de la FDA para la industria, Productos farmacéuticos estériles producidos por procesamiento aséptico – Buenas prácticas de fabricación actuales, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Administración de Alimentos y Medicamentos, septiembre de 2004. 

6. Datos internos de STERIS Corporation, no publicados. 

7. McDonnell, G.E. “Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance,” ASM Press, Washington, DC, 2007. 

8. Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., Inspecciones, cumplimiento, aplicación y investigaciones penales, carta de advertencia de Medimmune, Inc., 27 de mayo de 2007, http://www.fda.gov/ICECI/EnforcementActions/WarningLetters/2007/ucm076398.htm, consultado el 9 de mayo de 2011. 

9. GMP Trends Inc., Número 766, 15 de diciembre de 2008. 

10. Polarine, J., Macauley, J., Karanja, P., Klein, D., Martin, A., “Evaluating the Activity of Disinfectants Against Fungi,” Cleanrooms: The Magazine of Contamination Control Technology, 23 (2), febrero de 2009. 

11. Reglamento (CE) nº 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo de 18 de diciembre de 2006 sobre el registro, evaluación, autorización y restricción de productos químicos (REACH), que establece la Agencia Europea de Sustancias Químicas, enmendando la Directiva 1999/45/CE y deroga el Reglamento del Consejo (EEC) nº 793/93 y el Reglamento de la Comisión (CE) nº 1488/94, así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE, http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32006R1907:EN:NOT, consultado el 11 de julio de 2011.

12. BS EN 1650:2008. Desinfectantes químicos y antisépticos – Prueba de suspensión cuantitativa para la evaluación de la actividad fungicida de desinfectantes y antisépticos químicos utilizados en alimentos, industrias, uso doméstico e institucional (fase 2, paso 1). Disponible en British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., Londres W4 4AL, Reino Unido, http://www.bsi-global.com. 

13. BS EN 13697:2001. Desinfectantes químicos y antisépticos – Prueba de superficie no porosa cuantitativa para evaluar la actividad bactericida y/o fungicida de desinfectantes químicos utilizados en áreas alimentarias, industriales, domésticas e institucionales – Método de prueba y requisitos sin acción mecánica (fase 2/paso 2). Disponible en British Standards Institute (BSI), 389 Chiswick High Rd., Londres W4 4AL, Reino Unido, http://www.bsi-global.com. 

14. Método oficial AOAC 955.17 “Actividad fungicida de los desinfectantes”, Métodos oficiales de análisis de la AOAC, Decimoctava edición, AOAC International, 2005. 

15. Datos internos de STERIS Corporation, no publicados.