Collecte de germes dans les gaz de pression - pour des applications médicales et pharmaceutiques - Quelle méthode est optimale ?

Vanne de réduction standard

Fente d'étranglement fermée dans la valve

Ouverture de l'évent dans la soupape légèrement entrouverte

Brevet :

Dans la littérature spécialisée, on trouve diverses méthodes de collecte de germes végétatifs dans les gaz. Avec les appareils développés à cet effet, il est possible de déterminer et d'analyser le nombre de germes.

Particulièrement en ce moment, en période de Covid-19, la détection de germes bactériens par leur propriété à être également porteurs de virus est plus importante que jamais.

Une brève vue d'ensemble des principes physiques appliqués dans les différents dispositifs de collecte est présentée ici, accompagnée d'une évaluation. Les critères principaux (sans prétention à l'exhaustivité) sont exposés. L'appareil recommandé est présenté en fonction de ses caractéristiques principales.

Sédimentation (procédé par décantation)

Les particules sont déposées soit par gravité (collecte passive), soit par forces centrifuges (pour concentrer le volume de collecte, par exemple dans le cas d'aérosols - collecte active) sur des milieux nutritifs en boîte de Petri ou dans un liquide.

En raison des différentes tailles de particules, la collecte n'est pas représentative, car la masse des particules, le facteur temps pour la sédimentation ou l'adhérence au milieu nutritif jouent un rôle important. Ces facteurs/paramètres sont difficiles à quantifier précisément.

Évaluation : non adapté pour les gaz sous pression.

Impaction (impact sur des milieux nutritifs solides)

Une forte accélération des particules / germes par déviation, notamment via une mise en cascade ou des buses, génère la force nécessaire pour leur fixation sur des surfaces solides.

Grâce à l'inertie de masse, il est possible de fractionner facilement la taille des particules (mise en cascade) et d'améliorer leur adhérence aux surfaces.

Évaluation : partiellement adapté, si un dispositif de réduction de pression est présent avant la mise en contact des particules / germes (avec certaines limitations, voir « Sur quoi faut-il se concentrer » – dernier chapitre).

Centrifugation (procédé par force centrifuge)

Les particules, et donc aussi les germes, sont mises en rotation dans le gaz et accélérées fortement par la force centrifuge générée à haute vitesse orbitale, en fonction du rayon orbital. Elles peuvent ainsi être capturées sur des surfaces d'impact recouvertes de milieu nutritif.

Lors de l'utilisation pour des gaz, il ne faut généralement pas injecter de liquide dans le flux gazeux (pour éviter, par exemple, une concentration dans des gouttelettes liquides). Sinon, le liquide doit être validé avec le système.

En standard, les gaz sont soufflés sur des boîtes de Petri à l'aide d'une buse.

Évaluation : partiellement adapté, si un dispositif de réduction de pression est présent avant la mise en contact des particules / germes (avec certaines limitations, voir « Sur quoi faut-il se concentrer » – dernier chapitre).

Impaction (procédé par lavage gazeux)

Il s'agit d'une méthode spécifique de collecte basée sur le principe de l'inertie (voir impaction).

Le gaz (aérosol) est aspiré sous vide à travers un capillaire et dirigé par une buse dans un milieu de collecte liquide. Des vitesses pouvant atteindre la vitesse du son peuvent être atteintes. Cela peut endommager les cellules ou, par séparation, entraîner une croissance indésirable dans le milieu. En général, le milieu est une solution nutritive préalablement stérilisée. Cela peut aussi entraîner des adhérences cellulaires indésirables. Ensuite, le milieu chargé est filtré à travers un filtre aseptique.

Ce filtre est ensuite placé sur une boîte de Petri stérile, rempli d'un milieu nutritif approprié, puis incubé et sélectionné.

Évaluation : non adapté pour les gaz sous pression.

Filtration

Le gaz est dirigé à travers ou sur un matériau filtrant suspendu ou en membrane. Le mécanisme repose à nouveau sur le principe de l'inertie, avec son effet de séparation, ou/et sur la diffusion ou/et sur l'attraction électrostatique.

Pour la filtration par filtres à membrane, on utilise soit des disques filtrants stérilisés préalablement (pore de 0,2 µm), soit des filtres en gelatine soluble dans l'eau (pore de 0,45 µm).

Dans le premier cas, l'évaluation consiste à déposer le filtre sur des boîtes de Petri avec de l'agar et à incubé ; la détermination des unités formant colonies (UFC) suit.

Pour la filtration par gelatine soluble dans l'eau, celle-ci est dissoute dans un milieu liquide, et les germes sont détectés dans celui-ci (par exemple, virus de la grippe).

Évaluation : adaptée pour les gaz sous pression.

Sur quoi faut-il se concentrer ?

Sur le marché, seul un collecteur de germes, spécialement conçu pour les gaz sous pression, est disponible.

Il s'agit du collecteur de germes SCHICO M2000, construit selon les règles de la norme DIN EN ISO 14698.

Le système est validé (article publié dans : Pharm. Ind. 70, n° 2, 250–300 (2008)). Un brevet allemand a été délivré pour cet appareil, voir le document.

En résumé, voici les critères proposés pour le choix des méthodes :

- Recueil complet et exclusif du volume de gaz à tester (pas d'introduction d'un autre gaz, notamment d'air ambiant).
- Détermination / réglage précis et simple du volume de mesure avec une grande précision, réglé automatiquement (en cas de fluctuations de pression dans le réseau), plage réglable pour la quantité / volume de gaz : 1-16 m³.
- Temps court pour réaliser une mesure, par exemple environ 15 minutes pour 1 m³.
- Grande plage de pression variable pour le gaz à tester, par exemple 0,5 – 8 bar de surpression, sans organes de réduction (détendeurs), pour tester / collecter le gaz à la pression utilisée en production.

Ce qui évite que des germes végétatifs soient déjà tués avant l’analyse et ne soient donc pas détectés par la méthode habituelle.

Pour illustrer, trois images du dispositif de détente, comme on en trouve par exemple dans un régulateur de pression standard. Dans l’orifice de détente, des contraintes de cisaillement agissent, conduisant à une désactivation des germes végétatifs. La membrane cellulaire est rompue, notamment si la cellule est en phase de division.

Une réduction de pression similaire se produit également dans les buses, avec un effet destructeur. Lors de la détente à la sortie de la buse, une détente brutale peut également contribuer à la destruction cellulaire.

Les méthodes par impact et centrifugation réduisent la pression à quelques millibars au-dessus de la pression ambiante.

Réduire la pression, par exemple de 10 bar à 5 bar, ou de 5 à 1 bar, diminue déjà la charge en germes végétatifs dans le milieu à tester. Il est donc d’autant plus important de collecter les germes à la pression qui sera utilisée en fin de processus de gaz, afin de détecter le maximum de germes.

Pour générer la pression nécessaire à la charge d'une boîte de Petri ou d'une bande préparée dans le flux gazeux, celle-ci doit être réduite à des valeurs très faibles. C’est pourquoi ces méthodes collectent moins de germes végétatifs que ceux présents dans le milieu initial.

Ces méthodes exigent également une grande précision, car les milieux nutritifs peuvent être introduits dans la zone de prélèvement. Si, en raison d’erreurs techniques ou humaines, le milieu nutritif fuit de manière incontrôlée, il peut contaminer la pièce même en petites quantités.

- Les milieux nutritifs pour l’évaluation du nombre de germes ne doivent, si possible, pas être introduits dans la zone de prélèvement, surtout dans le cas d’une salle blanche.
Risque de contamination !
- De plus, si le point de prélèvement est une salle blanche, aucun gaz excédentaire provenant de l’appareil de prélèvement ne doit s’échapper dans la pièce. Il faut veiller à ce que les conduites d’évacuation (éventuellement stérilisables), fixées à l’appareil, n’affectent pas la précision de la mesure (en tenant compte de la différence de pression à la sortie / filtre / dispositif).
- Pour la méthode par filtration membranaire, le porte-filtre, y compris l’adaptateur (raccord à vis), doit être stérilisable et doit être placé à la zone de prélèvement en respectant la meilleure hygiène possible avant la mesure. La distance entre le point de mesure et l’adaptateur doit être la plus courte possible. La stérilisation par autoclave de ces pièces avec de la vapeur d’eau à plus de 20 minutes à 121°C est suffisante.
- Arrêt et déconnexion (débranchement de l’entrée et de la sortie) du flux gazeux si la pression initiale chute complètement lors de la mesure, avec signal d’alarme.
- Étant donné qu’aucun appareil ne doit libérer de particules ou de germes dans la salle blanche, la configuration des paramètres de mesure doit être effectuée à l’extérieur de la salle blanche. Ensuite, le boîtier (adapté à la salle blanche) doit être fermé. Ce dernier doit ensuite être relié à la zone de prélèvement et connecté à la conduite d’évacuation.
- Utilisation de différents gaz inertes et d’air comprimé (par exemple pour l’air, l’oxygène et l’azote) avec une seule calibration du dispositif de mesure du volume (principe : débit massique), en respectant la précision requise.
- Alimentation en batterie de l’appareil avec une batterie d’une capacité suffisante pour réaliser 15 mesures de 1 m³ chacune.
- La calibration, le test de fonctionnement et la maintenance doivent être effectués exclusivement par le fabricant.
- Opération aussi simple et intuitive que possible.