Acumular microorganismos en gases comprimidos - para aplicaciones médicas y farmacéuticas - ¿Cuál es el método óptimo?

Válvula reductora habitual

Ranura de estrangulación cerrada en la válvula

Ranura de estrangulación en la válvula ligeramente abierta

Patente:

En la literatura especializada se encuentran diversos métodos para la recolección de gérmenes vegetativos en gases. Con los dispositivos desarrollados para ello, se puede realizar una determinación y evaluación de los recuentos de gérmenes.

Especialmente en la actualidad, en tiempos de COVID-19, la detección de gérmenes bacterianos, debido a su propiedad de ser portadores de virus, es más importante que nunca.

Se ofrece aquí una breve visión general de los principios físicos aplicados en los diversos dispositivos de recolección y se realiza una valoración. Se muestran los criterios más importantes (sin pretensión de exhaustividad). Se presenta el dispositivo recomendado en función de sus propiedades principales.

Sedimentación (método de decantación)

Las partículas se depositan mediante gravedad (recolección pasiva) o mediante fuerzas centrífugas (para concentrar el volumen de muestra, por ejemplo, en aerosoles - recolección activa) en medios nutritivos en placas de Petri o se recogen en un líquido.

Debido a las diferentes tamaños de partículas, la recolección no es representativa, ya que la masa de las partículas, el tiempo de sedimentación o la adhesión en la solución nutritiva juegan un papel importante. Estos factores/parámetros son difíciles de controlar.

Valoración: no apto para gases comprimidos.

Impactación (impacto en superficies sólidas)

Una aceleración fuerte de las partículas / gérmenes mediante desviación, incluso mediante conexión en cascada o boquillas, genera la fuerza necesaria para depositarlos en superficies sólidas.

Por la inercia de masa, se logra que el tamaño de las partículas pueda ser fraccionado fácilmente (con conexión en cascada) y que adhieran mejor a las superficies.

Valoración: parcialmente adecuado, si antes de depositar las partículas / gérmenes existe un dispositivo de reducción de presión (con restricciones, ver "¿En qué hay que fijarse?" - capítulo final).

Centrifugación (método por fuerza centrífuga)

Las partículas y, por tanto, también los gérmenes, se hacen girar en el gas y, mediante la fuerza centrífuga generada, se aceleran en dependencia del radio de la trayectoria a altas velocidades. Así, pueden ser capturados en superficies de impacto recubiertas con solución nutritiva.

En su aplicación para gases, generalmente no se debe inyectar líquido en el flujo de gas (para, por ejemplo, lograr una concentración en las gotas de líquido). En caso contrario, el líquido debe validarse junto con el sistema.

Normalmente, los gases se pulverizan sobre placas de Petri mediante una boquilla.

Valoración: parcialmente adecuado, si antes de depositar las partículas / gérmenes existe un dispositivo de reducción de presión (con restricciones, ver "¿En qué hay que fijarse?" - capítulo final).

Impacto (método de lavado de gases)

Se trata de una forma especial de recolección basada en el principio de inercia de masa (ver Impactación).

El gas (aerosol) se aspira con depresión a través de un tubo capilar y se conduce mediante una boquilla a un medio de recolección líquido. Se pueden alcanzar velocidades hasta la velocidad del sonido. Esto puede dañar las células o, mediante separación, provocar un crecimiento no deseado en el medio. Normalmente, el medio es una solución nutritiva previamente esterilizada. También puede ocurrir que las células se peguen de forma no deseada. Luego, el medio cargado se filtra a través de un filtro aséptico.

Este filtro se coloca sobre una placa de Petri estéril, se llena con medio nutritivo adecuado y luego se incuba y selecciona.

Valoración: no apto para gases comprimidos.

Filtración

El gas pasa a través de un material filtrante suspendido o en forma de membrana. El mecanismo se basa en el principio de inercia de masa con su efecto de separación y/o en difusión y/o en atracción electrostática.

Para la filtración con filtros de membrana, se utilizan discos filtrantes previamente esterilizados (poros de 0,2 µm) o gelatinas hidrosolubles (poros de 0,45 µm).

En el primer caso, la evaluación se realiza colocando el filtro en placas de Petri con agar y incubando; posteriormente, se determina la cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC).

Para la filtración con gelatina hidrosoluble, esta se disuelve en un medio líquido y se determinan los gérmenes (por ejemplo, virus de la influenza).

Valoración: adecuado para gases comprimidos.

¿En qué hay que fijarse?

En el mercado, solo se encuentra un colector de gérmenes específicamente desarrollado para gases comprimidos.

Este es el colector de gérmenes SCHICO M2000, construido según las normas de la DIN EN ISO 14698.

El sistema está validado (artículo publicado en: Pharm. Ind. 70, Nr. 2, 250–300 (2008)). Se ha concedido una patente alemana para el dispositivo, ver documento.

En resumen, los criterios propuestos para la selección de métodos son los siguientes:

- Captura completa y exclusiva del volumen de gas a analizar (sin inclusión de otros gases, en particular aire ambiente).
- Determinación / ajuste simple y precisa del volumen de medición con alta exactitud, regulado automáticamente (en caso de fluctuaciones de presión en la red), rango ajustable para la cantidad / volumen de gas: 1-16 m³.
- Tiempo breve para realizar una medición, por ejemplo, unos 15 minutos para 1 m³.
- Gran rango de presión ajustable para el gas a analizar, por ejemplo, 0,5 – 8 bar de sobrepresión, sin órganos reductores (válvulas de estrangulación), para analizar / recolectar el gas a la presión con la que se usará posteriormente en la producción.

De este modo, se evita que los gérmenes vegetativos sean eliminados antes del análisis y, por tanto, no se detecten con el método habitual.

Para ilustrar, se muestran tres imágenes del órgano de estrangulación, como se encuentra, por ejemplo, en un regulador de presión típico. En la rendija de estrangulación actúan tensiones cortantes que conducen a la desactivación de gérmenes vegetativos. La membrana celular se rompe, especialmente si la célula está en proceso de división.

También en las boquillas se produce una reducción de presión, similar a la de los órganos de estrangulación; también tienen efecto destructivo. Como en la salida de la boquilla se produce una rápida descompresión, esto puede contribuir a la destrucción celular.

Los métodos por impacto y centrifugación reducen la presión a unos pocos milibares por encima de la presión atmosférica.

Reducir la presión, por ejemplo, de 10 bar a 5 bar, o de 5 a 1 bar, ya disminuye el contenido de gérmenes vegetativos en el medio a analizar. Por ello, es aún más importante recolectar los gérmenes a la presión que posteriormente prevalecerá en la aplicación del gas, para captar la mayor cantidad posible.

Para generar la presión justo necesaria para cargar una placa de Petri llena de solución nutritiva o una tira preparada para ello en el flujo de gas, hay que reducirla a valores muy bajos. Por ello, estos métodos detectan menos gérmenes vegetativos que los presentes en el medio previamente.

Estos métodos también requieren una atención muy cuidadosa, ya que los medios nutritivos se introducen en la zona de muestreo. Si por errores técnicos o humanos la solución nutritiva se escapa de forma incontrolada, puede contaminar el ambiente incluso con pequeñas cantidades.

- Los medios nutritivos para evaluar el recuento de gérmenes no deben introducirse en la zona de muestreo, especialmente en salas limpias.
Riesgo de contaminación!
- Además, si el lugar de muestreo es una sala limpia, no debe salir gas excesivo del dispositivo de muestreo al ambiente. Se debe asegurar que las tuberías de escape (posiblemente esterilizables), instaladas en el dispositivo, no afecten significativamente la precisión de la medición (considerando la diferencia de presión en el punto de recolección / filtro / dispositivo).
- En el método de filtración por membrana, el soporte del filtro, incluido el adaptador (conector), debe ser esterilizable y colocarse en el punto de muestreo antes de la medición, siguiendo las mejores prácticas higiénicas. Se debe prestar atención a que la conexión entre el punto de medición y el adaptador sea lo más corta posible. La autoclave previa de estas partes con vapor de agua a más de 20 minutos a 121°C es suficiente.
- Apagar y desconectar (desplazar la entrada y salida) del flujo de gas si la presión previa cae completamente durante la medición y se activa una alarma.
- Como en salas limpias no deben estar presentes dispositivos que liberen partículas o gérmenes, la configuración de los parámetros de medición debe realizarse fuera de la sala limpia. Luego, se debe cerrar la carcasa (apta para sala limpia) y conectarla a la zona de muestreo y a la salida de aire.
- Uso de diferentes gases inertes y aire comprimido (por ejemplo, para aire, oxígeno y nitrógeno) con una sola calibración del medidor de volumen (principio: flujo másico), respetando la precisión requerida.
- La batería del dispositivo debe tener suficiente capacidad para realizar 15 mediciones de 1 m³ cada una con una sola carga.
- La calibración, prueba de funcionamiento y mantenimiento deben ser realizados únicamente por el fabricante.
- Operación lo más sencilla y sencilla posible del dispositivo.