Zbieranie drobnoustrojów w gazach pod ciśnieniem - dla zastosowań medyczno-farmaceutycznych - Jaka metoda jest optymalna?

Typowy zawór redukcyjny

Zawór zamknięty w splicie zaworu

Mały otwór w zaworze lekko otwarty

Patent:

W literaturze odpowiedniej można znaleźć różne metody zbierania vegetatywnych zarodków w gazach. Przy użyciu opracowanych do tego urządzeń można dokonać oznaczenia i oceny liczby zarodków.

Aktualnie, szczególnie w czasach koronawirusa, wykrywanie zarodków bakteryjnych poprzez ich właściwość, jaką jest także bycie nośnikiem wirusów, jest ważniejsze niż kiedykolwiek.

Na temat stosowanych w różnych pojemnikach do zbierania zasad fizycznych przedstawiono tutaj krótki przegląd i ocenę. Zostały wskazane najważniejsze kryteria (bez pełnej wyczerpania). Przedstawiono również urządzenie zalecane na podstawie najważniejszych cech.

Sedymentacja (metoda opadania)

Cząsteczki są albo przez siłę ciężkości (bierne zbieranie), albo przez siły odśrodkowe (w celu koncentracji objętości zbierania, np. w aerozolach - aktywne zbieranie) nanoszone na podłoża odżywcze w płytkach Petriego lub zbierane w cieczy.

Ze względu na różne rozmiary cząstek, zbieranie nie jest reprezentatywne, ponieważ masa cząstek, czas opadania lub przyczepność do roztworu odżywczego odgrywają ważną rolę. Czynniki/parametry te są trudne do dokładnego pomiaru.

Ocena: nieodpowiednie dla gazów pod ciśnieniem.

Impaktacja (uderzenie na stałe podłoża odżywcze)

Silne przyspieszenie cząstek / zarodków przez odchylenie, także za pomocą kaskad lub dysz, generuje siłę potrzebną do przyklejenia na stałe powierzchnie.

Przez bezwładność masy osiąga się, że rozmiar cząstek może być łatwo frakcjonowany (kaskadowe ustawienie) i lepiej przylega do powierzchni.

Ocena: częściowo odpowiednie, jeśli przed nanoszeniem cząstek / zarodków istnieje urządzenie do redukcji ciśnienia (z ograniczeniem, patrz „Na czym to polega” – ostatni rozdział).

Wirówka (metoda odśrodkowa)

Cząstki, a tym samym zarodki, są wprowadzane w ruch obrotowy w gazie i przez wywołaną siłę odśrodkową przy wysokiej prędkości toru są mocno przyspieszane w zależności od promienia toru. W ten sposób mogą być następnie przechwytywane na powierzchniach uderzeniowych pokrytych roztworem odżywczym.

Przy stosowaniu do gazów, zwykle nie można wprowadzać cieczy do strumienia gazu (np. w celu zwiększenia koncentracji na kroplach cieczy). W przeciwnym razie ciecz musi być zwalidowana razem z systemem.

Standardowo gazy są rozpylane na płytki Petriego za pomocą dyszy.

Ocena: częściowo odpowiednie, jeśli przed nanoszeniem cząstek / zarodków istnieje urządzenie do redukcji ciśnienia (z ograniczeniem, patrz „Na czym to polega” – ostatni rozdział).

Impregnacja (metoda płukania gazowego)

Jest to specjalny rodzaj zbierania według zasady bezwładności (patrz Impaktacja).

Gaz ( aerozol) jest zasysany podciśnieniem przez kapilarną rurkę i kierowany za pomocą dyszy do cieczy zbierającej. Można osiągnąć prędkości do poziomu prędkości dźwięku. To może uszkodzić komórki lub – przez separację – prowadzić do niepożądanego wzrostu w medium. Zazwyczaj medium to jest wcześniej sterylizowanym roztworem odżywczym. Może to również powodować niepożądane zlepianie się komórek. Następnie naładowane medium jest filtrowane przez aseptyczny filtr.

Filtr ten jest następnie umieszczany na sterylnej płytce Petriego, napełniany odpowiednim roztworem odżywczym i inkubowany, a następnie wybrany i zliczony.

Ocena: nieodpowiednie dla gazów pod ciśnieniem.

Filtracja

Gaz jest kierowany przez zawieszone lub membranowe materiały filtracyjne. Mechanizm opiera się na zasadzie bezwładności z jej efektem zatrzymania lub/i dyfuzji lub/i oddziaływania elektrostatycznego.

Przy filtracji przez membranowe filtry stosuje się zarówno wcześniej sterylizowane filtry (o porowatości 0,2 µm), jak i rozpuszczalne w wodzie żele (o porowatości 0,45 µm).

Pierwsza metoda polega na analizie przez nałożenie na płytki Petriego z agarem i inkubację; następnie wyznacza się liczbę jednostek tworzących kolonie (JTK).

Przy filtracji przez rozpuszczalne w wodzie żele, żel rozpuszcza się w cieczy i z niej wyznacza zarodki (np. wirusy grypy).

Ocena: odpowiednie dla gazów pod ciśnieniem.

Na czym to polega?

Na rynku dostępny jest tylko jeden zbieracz zarodków, który został specjalnie opracowany do gazów pod ciśnieniem.

Jest to SCHICO - zbieracz zarodków M2000, zbudowany zgodnie z normami DIN EN ISO 14698.

System jest zwalidowany (artykuł opublikowany w: Pharm. Ind. 70, Nr. 2, 250–300 (2008)). Dla urządzenia wydano niemiecki patent, patrz dokument.

Podsumowując, dla wyboru metod można przyjąć następujące, tutaj proponowane kryteria:

- Całkowite i wyłączne zebranie objętości gazu do badania (bez wprowadzenia innego gazu, szczególnie powietrza otoczenia).
- Prosta i dokładna regulacja / ustawienie objętości pomiaru z wysoką precyzją, automatycznie regulowana (w przypadku wahań ciśnienia w sieci), zakres ustawienia dla ilości / objętości gazu: 1-16 m³.
- Krótki czas wykonania pomiaru, np. dla 1 m³ około 15 minut.
- Duży, zmienny zakres ciśnienia do badania gazu, np. 0,5 – 8 barów nadciśnienia, bez elementów redukcyjnych (dławików), aby móc badać / zbierać gaz pod ciśnieniem, w którym będzie używany w produkcji.

W ten sposób unika się sytuacji, w której vegetatywne zarodki są już przed oceną zabite i nie są wykrywane za pomocą zwykłej metody analizy.

W celu wyjaśnienia zamieszczono trzy zdjęcia elementu dławika, jak jest on na przykład stosowany w zwykłym urządzeniu do redukcji ciśnienia. W szczelinie dławika działają naprężenia ścinające, które prowadzą do dezaktywacji vegetatywnych zarodków. Membrana komórkowa jest rozrywana, szczególnie gdy komórka znajduje się w stanie podziału.

W dyszach również dochodzi do redukcji ciśnienia, podobnej do tej w elementach dławikowych; ma ona również działanie destrukcyjne. Ze względu na nagłe rozprężenie ciśnienia przy wylocie dyszy, może to również przyczynić się do zniszczenia komórek.

Metody oparte na impaktacji i odśrodkowej redukują ciśnienie do kilku milibarów powyżej ciśnienia otoczenia.

Redukcja ciśnienia z np. 10 barów do 5 barów, lub z 5 do 1 bara, już zmniejsza ilość vegetatywnych zarodków w badanym medium. Dlatego szczególnie ważne jest zbieranie zarodków przy ciśnieniu, które będzie później obowiązywać w zastosowaniu gazu, aby jak najpełniej wykryć wszystkie zarodki.

Aby wywołać ciśnienie niezbędne do załadowania płytki Petriego lub podobnego elementu w strumieniu gazu, które jest jeszcze potrzebne, konieczne jest jego obniżenie do bardzo małych wartości. Dlatego te metody rejestrują mniej vegetatywnych zarodków, niż było ich wcześniej w medium.

Metody te wymagają także dużej staranności, ponieważ odżywki są wprowadzane do przestrzeni pobierania próbek. Jeśli z powodu błędów technicznych lub ludzkich odżywka wycieknie niekontrolowanie, zanieczyści ona pomieszczenie nawet przy najmniejszych ilościach.

- Odżywki do oceny liczby zarodków nie powinny być wprowadzane do przestrzeni pobierania próbek, szczególnie w przypadku pomieszczeń czystych.
Ryzyko zanieczyszczenia!
- Ponadto, jeśli miejsce pobierania próbek jest pomieszczeniem czystym, nie może z niego wydostać się nadmiar gazu z urządzenia do pobierania próbek. Należy zadbać, aby przewody odprowadzające gazy (ewentualnie sterylizowalne), zamocowane na urządzeniu, nie wpływały istotnie na dokładność pomiaru (należy uwzględnić różnicę ciśnień na miejscu zbierania / filtrze / urządzeniu).
- Przy metodzie filtracji membranowej, uchwyt filtra musi być sterylizowalny, wraz z adapterem (złącze), i przed pomiarem musi być zamocowany w miejscu pobierania próbek, z zachowaniem najlepszych praktyk higienicznych. Należy zwrócić uwagę na najkrótszą drogę między miejscem pomiaru a adapterem. Wystarczające jest autoklawowanie tych elementów przez ponad 20 minut w parze wodnej w temperaturze 121°C.
- Wyłączenie i odłączenie (wysunięcie dopływu i odpływu) strumienia gazu, jeśli ciśnienie wstępne podczas pomiaru spadnie całkowicie i pojawi się alarm.
- Ponieważ w pomieszczeniu czystym nie mogą znajdować się urządzenia emitujące cząstki lub zarodki, ustawienie niezbędnych parametrów pomiarowych powinno być wykonane poza pomieszczeniem czystym. Następnie obudowa (odpowiednia do pomieszczeń czystych) powinna być zamknięta. Dopiero wtedy można ją połączyć z miejscem pobierania próbek i podłączyć do odciągu.

- Użycie różnych gazów obojętnych i sprężonego powietrza (np. dla powietrza, tlenu i azotu) z jedną kalibracją urządzenia do pomiaru objętości (zasada: pomiar masowego przepływu) przy zachowaniu wymaganej dokładności.
- Zasilanie urządzenia na baterie z akumulatorem o wystarczającej pojemności do wykonania 15 pomiarów po 1 m³ każdorazowo.
- Kalibracja, testy funkcjonalne i konserwacja powinna być przeprowadzana wyłącznie przez producenta.
- Jak najprostsza i najbardziej intuicyjna obsługa urządzenia.