In drukgassen microben verzamelen - voor medische en farmaceutische toepassingen - Welke methode is optimaal?

Gebruikelijk reductieventiel

Drosselspalt im Ventil geschlossen

Klepopening in het ventiel iets geopend

Octrooi:

In de relevante literatuur vindt men diverse methoden voor het verzamelen van vegetatieve kiemen in gassen. Met de daarvoor ontwikkelde apparaten kan een bepaling en evaluatie van de kiemgetallen plaatsvinden.

Juist nu, in coronatijden, is de detectie van bacteriële kiemen door hun eigenschap om ook dragersubstantie voor virussen te zijn, belangrijker dan ooit.

Over de in de verschillende verzamelapparaten toegepaste fysieke principes wordt hier een korte overzicht gegeven en voorzien van een beoordeling. De belangrijkste criteria (zonder volledige volledigheid) worden weergegeven. Het aanbevolen apparaat wordt gepresenteerd op basis van de belangrijkste eigenschappen.

Sedimentatie (Afzetmethode)

De deeltjes worden ofwel door zwaartekracht (passieve verzameling) of door centrifugale krachten (voor concentratie van het verzamelvolume, bijvoorbeeld bij aerosolen - actieve verzameling) op voedingsbodems in petrischalen geïnoculeerd of in een vloeistof verzameld.

Door de verschillende deeltjesgroottes is de verzameling niet representatief, omdat de massa van de deeltjes, de tijdsfactor voor sedimentatie of de hechting aan de voedingsoplossing hierbij een belangrijke rol speelt. Bij deze factoren/parameters gaat het om moeilijk te meten invloedsfactoren.

Beoordeling: ongeschikt voor persgassen.

Impactie (botsing op vaste voedingsbodems)

Een sterke versnelling van de deeltjes / kiemen door omleiding, ook via cascadeschakeling of via nozzles, creëert de kracht die nodig is om op vaste oppervlakken aan te brengen.

Door de traagheid van de massa wordt bereikt dat de deeltjesgrootte gemakkelijk gefractioneerd kan worden (cascade) en dat ze beter op oppervlakken hechten.

Beoordeling: gedeeltelijk geschikt, mits vóór het aanbrengen van de deeltjes / kiemen een inrichting voor drukreductie aanwezig is (met beperking, zie 'Waarop komt het aan' – laatste hoofdstuk).

Centrifugatie (Centrifugaal kracht methode)

De deeltjes en daarmee ook kiemen worden in het gas in rotatie gebracht en door de gegenereerde massacentrifugale kracht bij hoge baansnelheid afhankelijk van de baanstraal sterk versneld. Zo kunnen ze vervolgens op stootvlakken, die met voedingsoplossing zijn bedekt, worden opgevangen.

Bij toepassing voor gassen mag in de regel geen vloeistof in de gasstroom worden geïnjecteerd (bijvoorbeeld om een verrijking aan vloeistofdruppels te bereiken). Anders moet de vloeistof samen met het systeem worden gevalideerd.

Standaard worden de gassen via een nozzle op petrischalen geblazen.

Beoordeling: gedeeltelijk geschikt, mits vóór het aanbrengen van de deeltjes / kiemen een inrichting voor drukreductie aanwezig is (met beperking, zie 'Waarop komt het aan' – laatste hoofdstuk).

Impacter (Gaswasproces)

Hier gaat het om een speciale vorm van verzameling volgens het massatragheidsprincipe (zie Impactie).

Het gas (aerosol) wordt onder vacuüm via een capillairbuis aangezogen en via een nozzle in een vloeibaar verzamelmedium geleid. Daarbij kunnen snelheden worden bereikt tot aan de geluidssnelheid. Dit kan zowel cellen beschadigen als – door scheiding – leiden tot ongewenste groei in het medium. In de regel is het medium een vooraf gesteriliseerde voedingsoplossing. Hierbij kunnen ook ongewenste cellen kleven. Vervolgens wordt het beladen medium gefilterd via een aseptisch filter.

Dit filter wordt vervolgens op een steriele petrischaal gelegd, gevuld met geschikt voedingsmedium en daarna geïncubeerd en uitgezocht.

Beoordeling: ongeschikt voor persgassen.

Filtratie

Hierbij wordt het gas door of over een suspensie- of membraanachtig filtermateriaal geleid. Het mechanisme berust opnieuw op het principe van massatragheid met scheidingseffect en/of diffusie en/of elektrostatische aantrekking.

Bij filtratie met membraanfilters worden zowel vooraf gesteriliseerde filterschijven (0,2 µm poriegrootte) als wateroplosbare gelatinefilters (0,45 µm poriegrootte) gebruikt.

Bij de eerste wordt de evaluatie gedaan door het vervolgens op een petrischaal met agar te leggen en te incuberen; daarna volgt de bepaling van de KBE (kolonievormende eenheden).

Bij filtratie met wateroplosbare gelatine wordt deze opgelost in een vloeibaar medium en worden de kiemen daarvan bepaald (bijvoorbeeld influenzavirussen).

Beoordeling: geschikt voor persgassen.

Waarop komt het aan?

Op de markt is slechts één kiemverzamelaar te vinden, die speciaal is ontwikkeld voor persgassen.

Dit is de SCHICO-kiemverzamelaar M2000, gebouwd volgens de regels van DIN EN ISO 14698.

Het systeem is gevalideerd (artikel verschenen in: Pharm. Ind. 70, Nr. 2, 250–300 (2008)). Voor het apparaat is een Duits octrooi verleend, zie de akte.

Samenvattend zijn er voor de keuze van methoden de volgende, hier voorgestelde, criteria:

- Volledige en exclusieve registratie van het te testen gasvolume (geen bijvangst van een ander gas, vooral niet van omgevingslucht).
- Eenvoudige en exacte bepaling / instelling van het meetvolume met hoge nauwkeurigheid, automatisch geregeld (indien drukschommelingen in het netwerk voorkomen), instelbaar bereik voor gashoeveelheid/volume: 1-16 m³.
- Korte tijd voor het uitvoeren van een meting, bijvoorbeeld ongeveer 15 min voor 1 m³.
- Groot, variabel instelbaar drukbereik voor het te testen gas, bijvoorbeeld 0,5 – 8 bar overdruk, zonder reductie-inrichtingen (drosselinrichtingen), om het gas met de druk te testen/verzamelen, waarmee het later in de productie wordt gebruikt.

Hierdoor wordt voorkomen dat vegetatieve kiemen al vóór de evaluatie worden gedood en dus niet worden vastgelegd met de gebruikelijke evaluatiemethode.

Ter verduidelijking drie afbeeldingen van het drosselorgaan, zoals deze bijvoorbeeld in een gebruikelijke drukreducerende inrichting te vinden is. In de drosselspalt werken scheurspanningen die leiden tot deactivering van vegetatieve kiemen. De celmembraan wordt doorbroken, vooral wanneer de cel zich in delingsfase bevindt.

Ook in nozzles vindt drukreductie plaats, vergelijkbaar met die in drosselorganen; deze heeft eveneens een destructieve werking. Omdat bij de uitgang van de nozzle plotseling de druk ontlast wordt, kan dit ook bijdragen aan celdoding.

Methoden volgens het impactie- en centrifugatieproces verlagen de druk tot enkele millibar boven de omgeving.

Het verlagen van de druk van bijvoorbeeld 10 bar naar 5 bar, of van 5 naar 1 bar, vermindert al het vegetatieve kiemgehalte in het te testen medium. Het is daarom extra belangrijk om de kiemen te verzamelen bij de druk die later bij het gasgebruik geldt, om zo mogelijk alle kiemen te detecteren.

Om de net nog benodigde druk voor het beladen van een met voedingsoplossing gevulde petrischaal of een daartoe voorbereid strookje in de gasstroom te genereren, moet op zeer kleine waarden worden gereduceerd. Daarom registreren deze methoden minder vegetatieve kiemen dan oorspronkelijk in het medium aanwezig waren.

Ook vereisen deze methoden een zeer grote zorgvuldigheid, omdat voedingsmedia in de ruimte van de monstersampling worden ingebracht. Als door technische of menselijke fouten de voedingsoplossing oncontroleerbaar lekt, verontreinigt deze de ruimte al bij minimale hoeveelheden.

- Voedingsmedia voor het evalueren van het kiemgetal dienen bij voorkeur niet in de ruimte van de monstersampling te worden ingebracht, vooral niet in een cleanroom.
Contaminatierisico!
- Verder geldt: als de plaats van monstersampling een cleanroom is, mag geen overtollig gas uit het monstersamplingapparaat in de ruimte ontsnappen. Er moet op worden gelet dat uitlaatleidingen (eventueel steriliseerbaar), bevestigd aan het apparaat, de nauwkeurigheid van de meting niet wezenlijk beïnvloeden (de differentiedruk op de verzamelplek/filter/apparaat moet hierbij worden gecontroleerd).
- Bij de membraanfiltratiemethode moet de filterhouder inclusief de adapter (koppelpijpje) steriel kunnen worden gemaakt en vóór de meting onder de best mogelijke hygiënische omstandigheden op de monstersamplingplaats worden aangebracht. Let op de kortste afstand tussen meetpunt en adapter. Het vooraf autoclaven van deze onderdelen met stoom onder 20 min bij 121°C is voldoende.
- Uitschakeling en loskoppeling (schuiven van toevoer- en afvoerleiding) van de gasstroom, indien de voordruk tijdens de meting volledig wegvalt en een storing wordt gemeld.
- Omdat zich in de cleanroom geen apparaten mogen bevinden die deeltjes of kiemen afgeven, moet de instelling van de benodigde meetparameters op het apparaat buiten de cleanroom worden uitgevoerd. Vervolgens moet de behuizing (cleanroomgeschikt) worden gesloten. Daarna wordt deze verbonden met de monstersampling en aangesloten op de afvoerlucht.
- Gebruik van verschillende inert gassen en perslucht (bijvoorbeeld voor lucht, zuurstof en stikstof) met slechts één kalibratie van het volumemeter (principe: massastroom), met inachtneming van de vereiste nauwkeurigheid.
- Batterijvoeding van het apparaat met een accu met voldoende capaciteit om 15 metingen van elk 1 m³ uit te voeren.
- Kalibratie, functietest en onderhoud moeten uitsluitend door de fabrikant worden uitgevoerd.
- Zo eenvoudig en gebruiksvriendelijk mogelijk bedienen van het apparaat.