Raccogliere microbi nel gas di pressione - per applicazioni medico-farmaceutiche - Qual è il metodo ottimale?

Valvola riduttrice normale

Serratura della valvola chiusa

Piccolo spillo nel ventilatore leggermente aperto

Brevet:

Nella letteratura di settore si trovano diverse metodologie per la raccolta di germi vegetativi nei gas. Con gli apparecchi sviluppati a tal fine, è possibile determinare e analizzare il numero di germi.

Proprio in tempi di pandemia, la rilevazione di germi batterici, grazie alla loro proprietà di essere anche vettori di virus, è più importante che mai.

Viene qui fornita una breve panoramica sui principi fisici applicati nei vari contenitori di raccolta, accompagnata da una valutazione. Sono evidenziati i criteri principali (senza pretese di completezza). L’apparecchio raccomandato viene presentato in base alle caratteristiche più importanti.

Sedimentazione (metodo di decantazione)

Le particelle vengono depositate tramite gravità (raccolta passiva) o tramite forze centrifughe (per concentrare il volume di raccolta, ad esempio negli aerosol - raccolta attiva) su substrati nutritivi in piastre di Petri o raccolte in un liquido.

A causa delle diverse dimensioni delle particelle, la raccolta non è rappresentativa, poiché la massa delle particelle, il fattore tempo per la sedimentazione o l’adesione al liquido nutritivo svolgono un ruolo importante. Questi fattori/parametri sono di difficile misurazione.

Valutazione: inadatto per gas compressi.

Impatto (urto su superfici solide nutritive)

Una forte accelerazione delle particelle / germi tramite deviazione, anche tramite cascata o ugelli, genera la forza necessaria per l’applicazione su superfici solide.

Per inerzia di massa si ottiene che le particelle di dimensioni più piccole possono essere facilmente frazionate (cascata) e aderire meglio alle superfici.

Valutazione: parzialmente idoneo, se prima dell’applicazione delle particelle / germi è presente un dispositivo di riduzione della pressione (con limitazioni, vedi "A cosa bisogna prestare attenzione" – ultimo capitolo).

Centrifugazione (metodo di forza centrifuga)

Le particelle e quindi anche i germi vengono messe in rotazione nel gas e, grazie alla forza centrifuga generata, accelerano notevolmente in base al raggio della traiettoria. Così possono essere catturate su superfici di impatto rivestite di liquido nutritivo.

Per l’applicazione ai gas, di norma, non si deve iniettare liquido nel flusso gassoso (per esempio, per arricchire il campione con liquido). In caso contrario, il liquido deve essere validato insieme al sistema.

Di norma, i gas vengono soffiati su piastre di Petri tramite ugelli.

Valutazione: parzialmente idoneo, se prima dell’applicazione delle particelle / germi è presente un dispositivo di riduzione della pressione (con limitazioni, vedi "A cosa bisogna prestare attenzione" – ultimo capitolo).

Impingement (metodo di lavaggio del gas)

Si tratta di una modalità speciale di raccolta basata sul principio della forza centrifuga (vedi Impatto).

Il gas (aerosol) viene aspirato sotto depressione attraverso un capillare e condotto tramite ugello in un mezzo di raccolta liquido. Si possono raggiungere velocità fino alla velocità del suono. Questo può danneggiare le cellule o, tramite separazione, portare a una crescita indesiderata nel mezzo. In genere, il mezzo è una soluzione nutritiva sterilizzata in precedenza. Può anche verificarsi un’adesione indesiderata delle cellule. Successivamente, il mezzo caricato viene filtrato tramite un filtro asettico.

Questo filtro viene quindi posizionato su una piastra di Petri sterile, riempito con un mezzo nutritivo adeguato e successivamente incubato e selezionato.

Valutazione: inadatto per gas compressi.

Filtrazione

Il gas viene fatto passare attraverso un materiale filtrante sospeso o a membrana. Il meccanismo si basa ancora sul principio della forza centrifuga con effetto di separazione e/o sulla diffusione e/o sull’attrazione elettrostatica.

Per la filtrazione con filtri a membrana si utilizzano sia dischi filtranti sterilizzati (porosità 0,2 µm) sia filtri di gelatina solubile in acqua (porosità 0,45 µm).

Nel primo caso, si valuta mediante successivo posizionamento su piastre di Petri con agar e incubazione; segue la determinazione delle unità formanti colonie (UFC).

Per la filtrazione con gelatina solubile in acqua, questa viene sciolta in un mezzo liquido e si determinano i germi presenti (ad esempio, virus dell’influenza).

Valutazione: idoneo per gas compressi.

A cosa bisogna prestare attenzione?

Sul mercato sono disponibili solo alcuni raccoglitori di germi specificamente sviluppati per i gas compressi.

Si tratta del raccoglitore di germi SCHICO M2000, costruito secondo le norme DIN EN ISO 14698.

Il sistema è stato validato (articolo pubblicato su: Pharm. Ind. 70, Nr. 2, 250–300 (2008)). È stato rilasciato un brevetto tedesco per il dispositivo, vedi certificato.

In sintesi, i criteri proposti per la scelta dei metodi sono i seguenti:

- Rilevamento completo ed esclusivo del volume di gas da analizzare (nessuna contaminazione da altri gas, in particolare aria ambiente).
- Determinazione / impostazione semplice e precisa del volume di misura con alta accuratezza, regolata automaticamente (in presenza di variazioni di pressione nella rete), intervallo impostabile per quantità/volume di gas: 1-16 m³.
- Breve tempo di esecuzione di una misurazione, ad esempio circa 15 minuti per 1 m³.
- Ampio intervallo di pressione variabile per il gas da analizzare, ad esempio 0,5 – 8 bar sovrappressione, senza organi di riduzione (regolatori di flusso), per verificare / raccogliere il gas alla pressione usata in produzione.

In questo modo si evita che i germi vegetativi siano già eliminati prima dell’analisi e quindi non rilevati con il metodo di analisi usuale.

Per chiarimenti, tre immagini dell’organo di by-pass, come si trova ad esempio in un comune riduttore di pressione. Nel passaggio di by-pass si attivano tensioni di taglio che portano a una disattivazione dei germi vegetativi. La membrana cellulare viene rotta, specialmente se la cellula si trova in fase di divisione.

Anche negli ugelli si verifica una riduzione di pressione, simile a quella degli organi di by-pass; essa ha un effetto distruttivo. Poiché all’uscita dell’ugello si verifica un rapido rilassamento di pressione, ciò può contribuire alla distruzione cellulare.

I metodi di impatto e centrifugazione riducono la pressione a pochi millibar sopra la pressione ambientale.

Ridurre la pressione, ad esempio da 10 bar a 5 bar, o da 5 a 1 bar, diminuisce già il contenuto di germi vegetativi nel mezzo da analizzare. È quindi ancora più importante raccogliere i germi alla pressione che si avrà in seguito nell’applicazione del gas, per rilevare il maggior numero possibile di germi.

Per generare la pressione necessaria per il caricamento di una piastra di Petri riempita con liquido nutritivo o di una striscia preparata a tale scopo nel flusso di gas, bisogna ridurla a valori molto bassi. Per questo, questi metodi rilevano meno germi vegetativi rispetto a quelli presenti nel mezzo prima della raccolta.

Questi metodi richiedono inoltre molta attenzione, poiché i mezzi nutritivi vengono introdotti nell’area di campionamento. Se, a causa di errori tecnici o umani, il liquido nutritivo fuoriesce incontrollato, può contaminare l’ambiente anche con piccole quantità.

- I mezzi nutritivi per l’analisi del numero di germi dovrebbero essere preferibilmente evitati nell’area di campionamento, specialmente in ambienti sterili.
Rischio di contaminazione!
- Inoltre, se il punto di campionamento è un ambiente sterile, non deve fuoriuscire gas in eccesso dal dispositivo di campionamento nel ambiente. È importante che i tubi di scarico (eventualmente sterilizzabili), collegati alla apparecchiatura, non influenzino significativamente la precisione della misurazione (si deve considerare la differenza di pressione nel punto di raccolta / filtro / dispositivo).

- Per il metodo di filtrazione a membrana, il supporto del filtro, incluso l’adattatore (nipplo di collegamento), deve essere sterilizzabile e deve essere posizionato sulla zona di campionamento prima della misurazione, seguendo le migliori pratiche igieniche. È importante che il percorso tra punto di misurazione e adattatore sia il più breve possibile. La sterilizzazione preventiva di queste parti con vapore acqueo a oltre 20 minuti a 121°C è sufficiente.

- Spegnimento e disconnessione (scorrimento dell’ingresso e dell’uscita) del flusso di gas nel caso in cui la pressione precedente si azzeri completamente durante la misurazione e venga segnalato un errore.

- Poiché nel ambiente sterile non devono essere presenti apparecchi che rilasciano particelle o germi, la regolazione dei parametri di misurazione deve essere effettuata fuori dall’ambiente sterile. Successivamente, la custodia (adatta all’ambiente sterile) deve essere chiusa. Solo dopo si collega alla zona di campionamento e si collega alla condotta di scarico.

- Uso di diversi gas inerti e aria compressa (ad esempio, per aria, ossigeno e azoto) con una sola calibrazione dello strumento di misura del volume (principio: flusso di massa), rispettando la precisione richiesta.

- Alimentazione a batteria dell’apparecchio con una batteria di capacità sufficiente per eseguire 15 misurazioni da 1 m³ ciascuna con una carica.

- La calibrazione, i test di funzionamento e la manutenzione devono essere eseguiti esclusivamente dal produttore.

- Operazione il più semplice e intuitiva possibile dell’apparecchio.