Sbírat mikroby v stlačených plynech - pro medicínské a farmaceutické použití - Jaká metoda je optimální?

Obvyklý redukční ventil

Závěrka ventilu uzavřená

Malý otvor v ventilu trochu otvorený

Patent:

V relevantní literatuře najdete různé metody sběru vegetativních mikroorganismů ve vzduchu. S použitím vyvinutých zařízení lze provést stanovení a vyhodnocení počtu mikroorganismů.

Obzvláště aktuální, v době koronaviru, je důležitost detekce bakteriálních mikroorganismů díky jejich vlastnosti, že mohou být nositeli virů.

O fyzikálních principech používaných v různých sběrných zařízeních je zde krátký přehled s hodnocením. Ukazují se hlavní kritéria (bez nároku na úplnost). Doporučené zařízení je představeno na základě nejdůležitějších vlastností.

Sedimentace (odstředivá metoda)

Částice jsou buď zachycovány gravitační silou (pasivní sběr), nebo odstředivou silou (pro koncentraci sbíraného objemu, např. aerosolů - aktivní sběr) na živných půdách v Petriho miskách nebo jsou shromažďovány v kapalině.

Vzhledem k rozdílným velikostem částic není sběr reprezentativní, protože hmotnost částic, časový faktor sedimentace nebo jejich přilnavost k živnému roztoku hrají důležitou roli. Tyto faktory/parametry jsou složité k přesnému zachycení.

Hodnocení: nevhodné pro tlakové plyny.

Impaktace (dopad na pevné živné půdy)

Silné zrychlení částic/mikroorganismů pomocí odklonu, například přes kaskádové řazení nebo trysky, vytváří sílu potřebnou k přichycení na pevné povrchy.

Využitím setrvačnosti je dosaženo, že velikost částic může být snadno frakcionována (kaskádové řazení) a lépe se přichytí na povrchy.

Hodnocení: částečně vhodné, pokud je před aplikací částic/mikroorganismů k dispozici zařízení na snížení tlaku (s omezením, viz „Na čem záleží“ – poslední kapitola).

Zcentrifugace (odstředivá metoda)

Částice, a tím i mikroorganismy, jsou v plynu uvedeny do rotace a díky vznikající odstředivé síle při vysoké rychlosti dráhy jsou silně urychleny v závislosti na poloměru dráhy. Následně mohou být zachyceny na nárazových plochách potažených živným roztokem.

Při použití pro plyny by se obvykle neměla do proudu plynu vnášet kapalina (například pro zvýšení koncentrace na kapkách kapaliny). Jinak je nutné kapalinu validovat společně se systémem.

Standardně jsou plyny nafukovány přes trysku na Petriho misky.

Hodnocení: částečně vhodné, pokud je před aplikací částic/mikroorganismů k dispozici zařízení na snížení tlaku (s omezením, viz „Na čem záleží“ – poslední kapitola).

Impregnace (metoda čištění plynem)

Jedná se o speciální způsob sběru podle principu setrvačnosti (viz Impaktace).

Plyn ( aerosol ) je odsáván podtlakem přes kapilární trubici a veden tryskou do kapalného sběrného média. Lze dosáhnout rychlostí až rychlosti zvuku. To může poškodit buňky nebo způsobit nežádoucí růst v médiu – například rozdělením. Obvykle je médiem sterilizovaný živný roztok. Mohou však také nastat nežádoucí slepení buněk. Následně je nasycené médium filtrováno aseptickým filtrem.

Tento filtr je poté položen na sterilní Petriho misku, naplněn vhodným živným médiem a následně inkubován a vybrán.

Hodnocení: nevhodné pro tlakové plyny.

Filtrace

Vzduch je veden přes suspendované nebo membránové filtrační materiály. Mechanismus opět vychází z principu setrvačnosti s jejich odlučovací schopností a/nebo difúzí či elektrostatickým přitahováním.

Při použití membránových filtrů se používají sterilizované filtrační destičky (s pórů 0,2 µm) nebo vodou rozpustné gelatínové filtry (s pórů 0,45 µm).

U prvního se vyhodnocení provádí následným položením na Petriho misky s agarem a inkubací; následuje stanovení počtu kolonií (KBE = kolonie tvořící jednotky).

U filtrace vodou rozpustným gelatínem je gelatín rozpuštěn v tekutém médiu a z něj jsou určovány mikroorganismy (například chřipkové viry).

Hodnocení: vhodné pro tlakové plyny.

Na čem záleží?

Na trhu je k dispozici pouze jeden mikroorganismový sběrač, který je speciálně navržen pouze pro tlakové plyny.

Jedná se o SCHICO mikroorganismový sběrač M2000, vyrobený podle pravidel DIN EN ISO 14698.

Systém je validován (článek publikovaný v: Pharm. Ind. 70, č. 2, 250–300 (2008)). Na zařízení bylo uděleno německé patentové osvědčení, viz dokument.

Shrnuto, pro výběr metod platí následující, zde navržená kritéria:

- Kompletní a výlučné zachycení objemu zkoušeného plynu (bez vedlejšího vstupu jiného plynu, zejména okolního vzduchu).
- Jednoduché a přesné stanovení/nastavení měřicího objemu s vysokou přesností, automaticky řízené (pokud jsou v síti tlakové výkyvy), nastavitelné rozmezí pro množství/objem plynu: 1–16 m³.
- Krátká doba potřebná k provedení měření, například pro 1 m³ asi 15 minut.
- Velký, variabilně nastavitelný tlakový rozsah pro zkoušený plyn, například 0,5 – 8 bar přetlak, bez redukčních prvků (dřívek), pro měření a sběr plynu, který se později používá ve výrobě.

Tím se zabrání tomu, že již před vyhodnocením jsou vegetativní mikroorganismy zničeny a nejsou zachyceny běžnou metodou.

Pro vysvětlení jsou zde tři obrázky od regulačního prvku, jak je například běžně součástí tlakové redukční stanice. V škrticím mezeře působí smykové napětí, které vede k deaktivaci vegetativních mikroorganismů. Buněčná membrána je narušena, zejména pokud je buňka v procesu dělení.

V tryskách dochází také ke snížení tlaku, podobně jako v regulačních zařízeních; mají také destruktivní účinek. Vzhledem k náhlému uvolnění tlaku při výstupu z trysky může dojít i k ničení buněk.

Metody podle impaktace a také odstředivých metod snižují tlak na několik milibarů nad okolní tlak.

Snížení tlaku například z 10 bar na 5 bar, nebo z 5 na 1 bar již snižuje vegetativní mikroorganismy v zkoušeném médiu. Čím důležitější je sběr mikroorganismů při tlaku, který bude použit při následném použití plynu, aby bylo zachyceno co nejvíce mikroorganismů.

Pro vytvoření právě potřebného tlaku pro naložení Petriho misky naplněné živným médiem nebo pro přípravu proužku ve vzdušném proudu je nutné tlak snížit na velmi nízké hodnoty. Proto tyto metody zachycují méně vegetativních mikroorganismů, než kolik jich bylo původně v médiu.

Tyto metody také vyžadují velkou pečlivost, protože živná média jsou vnesena do prostoru odběru vzorku. Pokud dojde k technickým nebo lidským chybám a živný roztok unikne nekontrolovaně, kontaminuje prostor i při malém množství.

- Živná média pro vyhodnocení počtu mikroorganismů by měla být co nejvíce zabráněna vniknutí do prostoru odběru, zejména pokud se jedná o čistý prostor.
Hrozba kontaminace!
- Dále platí: pokud je místo odběru čistý prostor, nesmí z odběrného zařízení unikat přebytečný plyn do prostoru. Je třeba dbát na to, aby odvodní potrubí (případně sterilizovatelné), připojené ke zařízení, neovlivnilo přesnost měření (je třeba sledovat rozdílový tlak na sběrném místě/filtru/zařízení).
- U membránové filtrace musí být držák filtru včetně adaptéru (přípojného šroubku) sterilizovatelný a před měřením správně hygienicky připojen na místo odběru vzorku. Je třeba dbát na co nejkratší vzdálenost mezi měřicím místem a adaptérem. Předchozí autoklávování těchto částí párou při teplotě nad 121°C po dobu 20 minut je dostačující.
- Vypnutí a odpojení (posunutí přívodu a odvodu) plynového proudu, pokud během měření úplně klesne předtlak a je hlášena porucha.
- Vzhledem k tomu, že v čistém prostoru nesmějí být zařízení, která uvolňují částice nebo mikroorganismy, měla by být nastavení potřebných měřicích parametrů provedena mimo čistý prostor. Poté je kryt (čistý prostor) uzavřen. Následně je připojen k odběrovému místu a k odvodnímu potrubí.
- Použití různých inertních plynů a stlačeného vzduchu (například pro vzduch, kyslík a dusík) s pouze jednou kalibrací objemového měřicího zařízení (princip: hmotnostní průtok) při dodržení požadované přesnosti.
- Napájení zařízení na baterii s dostatečnou kapacitou pro provedení 15 měření po 1 m³ na nabití.
- Kalibrace, funkční testování a údržba by měly být prováděny výhradně výrobcem.
- Co nejjednodušší a nejpřímější obsluha zařízení.