Utilisation du réacteur à biofilm CDC pour le nettoyage expérimental et la désinfection des surfaces de rouille sur acier inoxydable

Introduction 

Les micro-organismes existent dans les installations de processus comme dans la nature, rarement sous forme de cellules isolées ou de cultures pures. Ils existent plutôt sous forme de monocultures ou de communautés de cultures mixtes, composées de différents micro-organismes. Les micro-organismes présents sur un biofilm, comme par exemple les espèces de pseudomonades, sont généralement enfermés dans une matrice visqueuse de substances polymériques extracellulaires (EPS), qui est essentielle à leur survie. (1) Les EPS jouent un rôle essentiel dans l’augmentation de la tolérance aux influences environnementales, aux agents antimicrobiens et aux produits de nettoyage, une caractéristique liée à la formation de biofilm. Il est crucial d’éliminer les EPS avant le nettoyage ou la désinfection.

Des équipements de processus parfaitement propres seraient idéaux, mais cela reste rarement une réalité. Un dépôt d’oxyde de fer appelé rouging apparaît fréquemment lors de la fabrication de récipients, sur les conduites d’alimentation et à de nombreux autres endroits où des biofilms sont présents. Le rouging est provoqué par l’oxydation de l’acier au contact de solutions aqueuses. L’efficacité des produits de nettoyage et des biocides pour éliminer le biofilm et désinfecter les équipements peut être compromise en cas de rouging, car la rugosité de la surface et la surface du substrat augmentent. Ces deux effets peuvent favoriser une déviation microbienne accrue et encourager le développement du biofilm.

Objectif

Les surfaces en acier inoxydable couvertes de rouging sont des points problématiques courants dans les installations de processus en ce qui concerne le nettoyage et la désinfection. Dans cette étude, l’effort de nettoyage et de désinfection a été étudié sur des plaques en acier inoxydable recouvertes de rouging, avec un biofilm induit par P. aeruginosa, dans un système de réacteur CDC-Biofilm. Le nettoyage et la désinfection ont été évalués par une analyse de surface avec du carbone organiquement lié total (TOC), une inspection visuelle de la propreté et une étude de l’efficacité microbienne.

Méthode 

Préparation des plaques pour le réacteur CDC-Biofilm :

Des plaques (feuilles) en acier inoxydable 316L ont été passivées pendant au moins 60 minutes à 80°C avec un produit de nettoyage contenant 20% d’acide (plaques nues). Une partie de ces plaques passivées a été placée pendant 7 jours dans une solution d’eau salée aérée contenant des plaques en acier doux (plaques recouvertes de rouging). Le rouging préparé peut être éliminé en 10 minutes à 80°C avec un produit de nettoyage contenant 5% d’acide, avec peu de mouvement.

Développement du biofilm :

P. aeruginosa ATCC® 15442TM a été cultivée pendant 24 heures sur gélose R2A, transférée dans un bouillon nutritif Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) et agitée à 130 tours par minute (U/min) pendant 24 heures à 37°C, puis transférée dans le TSB (0,3 g/l) dans le réacteur CDC-Biofilm assemblé avec les plaques nues et recouvertes de rouging (2, 3). La culture dans le réacteur biofilm a été agitée pendant 24 heures à 125 U/min à température ambiante ou ambiante. Après les premières 24 heures, la culture a été renouvelée avec un nouveau milieu (TSB 0,3 g/l) à un débit de 11,7 ml/min.

Efficacité microbienne :

Après incubation, les plaques ont été retirées, d’abord plongées dans de l’eau déionisée stérile (DI), puis placées dans une boîte de Pétri stérile. Chaque plaque a été placée dans un tube conique de 50 ml. La méthode ASTM à tube unique a été utilisée pour tester un produit de nettoyage alcalin formulé (concentration de 1%) à 60°C. Le biofilm formé sur les plaques nues ou recouvertes de rouging a été exposé à 4 ml de solution de produit de nettoyage. Pour neutraliser la réaction, 36 ml de bouillon Letheen froid (~4°C) contenant de l’asolectine et du TWEEN® (LAT) ont été ajoutés à la solution de 4 ml, puis agités. Chaque plaque neutralisée a été soumise à trois cycles d’agitation de 30 secondes à vitesse maximale, suivis d’un traitement par ultrasons de 30 secondes. Les échantillons prélevés ont été dilués en série dans la solution neutralisée. Les solutions diluées ont été versées sur un gélose LAT, étalées, puis incubées à 37°C pendant 2 jours.

Test TOC :

La méthode de nettoyage avec un produit de nettoyage alcalin formulé (concentration de 1%) a été évaluée. Les plaques nues et recouvertes de rouging, avec ou sans biofilm de P. aeruginosa, ont été séchées à l’air pendant au moins 24 heures avant le nettoyage. (4) Le traitement consistait à plonger les plaques dans 1 litre de produit de nettoyage préchauffé à 30°C et agité à 300 U/min. Les plaques ont été nettoyées pendant 5 minutes, rincées à l’eau déionisée, puis essuyées avec des tampons en polyester à faible teneur en TOC. Les tampons ont ensuite été soumis à une ultrasons pendant 15 minutes dans 40 ml d’eau déionisée, puis analysés pour le TOC.

Conclusion 

Le réacteur CDC-Biofilm et les méthodes ASTM associées constituent un système standard reproductible pour évaluer les difficultés de nettoyage et de désinfection liées à la formation de biofilm. Dans cette étude, ces méthodes standard ont été combinées avec la méthodologie STERIS pour la simulation de surfaces recouvertes de rouging, afin de créer pour la première fois un modèle d’acier inoxydable recouvert de rouging, puis de démontrer quantitativement et qualitativement que le rouging peut augmenter l’effort de nettoyage et de désinfection nécessaire pour éliminer le biofilm.

La contamination par biofilm représente un défi majeur pour les procédures régulières de nettoyage et de désinfection. Les surfaces recouvertes de rouging peuvent accélérer la formation de dépôts de surface et de biofilm, ainsi que renforcer les déviations microbiennes. Cet effet de synergie peut rapidement produire des agrégats tenaces de rouging/biofilm, comme dans cette étude simulée. Le test de nettoyage présenté ici démontre clairement que des stratégies efficaces de nettoyage, de maintenance préventive et de désinfection sont indispensables dans le cadre d’une régulation systématique de la contamination.

Références

(1) Hall-Stoodley, L. et Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. et Hamilton, M.A. (2007) Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., et Lopolito, P., (2013) The Use of CDC Biofilm Reactor to Test Cleaning Agents, Poster, Center for Biofilm Engineering Conference, Montana State University, 5.-6. février 2013.