Zastosowanie reaktorów biofilmu CDC do eksperymentalnego czyszczenia i dezynfekcji powierzchni rouging na stali nierdzewnej

Wprowadzenie

Mikroorganizmy występują w instalacjach procesowych, podobnie jak w naturze, rzadko jako pojedyncze komórki lub czysta kultura. Zazwyczaj istnieją jako kultura monokulturowa lub jako społeczność mieszana, składająca się z różnych mikroorganizmów. Mikroorganizmy na biofilmie, np. gatunki pseudomonad, są zazwyczaj zamknięte w śluzowej macierzy zewnętrznych substancji polimerowych (EPS), które są istotne dla ich przeżycia. (1) EPS odgrywają kluczową rolę w zwiększonej tolerancji na czynniki środowiskowe, środki przeciwbakteryjne i środki czystości, co jest cechą związaną z tworzeniem biofilmu. Kluczowe jest usunięcie EPS przed czyszczeniem lub dezynfekcją. 

Absolutnie czyste urządzenia procesowe byłyby idealne, lecz rzadko są rzeczywistością. Osad żelaza, zwany rougingiem, występuje często podczas produkcji zbiorników, na przewodach zasilających i wielu innych miejscach z biofilmem. Rouging jest wywoływany przez utlenianie stali podczas kontaktu z wodnymi roztworami. Skuteczność środków czystości i biobójczych do usuwania biofilmu i dezynfekcji urządzeń może być osłabiona przez rouging, ponieważ powierzchnia staje się szorstka, a powierzchnie podłoża zwiększają swoją porowatość. Oba te efekty mogą prowadzić do nasilenia mikrobiologicznych odchyleń i sprzyjać rozwojowi biofilmu.

Cel

Powierzchnie ze stali nierdzewnej pokryte rougingiem są częstym problemem w instalacjach procesowych w zakresie czyszczenia i dezynfekcji. W niniejszym badaniu oceniono nakład pracy związany z czyszczeniem i dezynfekcją stalowych blach pokrytych rougingiem, z biofilmem wywołanym przez P. aeruginosa, w systemie CDC-Biofilmreaktor. Czyszczenie i dezynfekcja zostały ocenione na podstawie analizy powierzchni, zawartości organicznego związku węgla (TOC), oceny czystości wizualnej oraz badania skuteczności mikrobiologicznej.

Metoda

Przygotowanie tarczy do CDC-Biofilmreaktor:

Tarczy CDC (płyty) ze stali nierdzewnej 316L zostały pasywowane przez co najmniej 60 minut w temperaturze 80°C w środku czyszczącym o kwasowości 20% (czyste płyty). Część tych pasywowanych płyt została umieszczona na 7 dni w napowietrzonej roztworze chlorku sodu, zawierającym stalowe blachy (płyty z rougingiem). Przygotowane płyty z rougingiem można usunąć w ciągu 10 minut w temperaturze 80°C przy niewielkim ruchu, używając środka czyszczącego o kwasowości 5%.

Rozwój biofilmu:

P. aeruginosa ATCC® 15442TM był hodowany przez 24 godziny na agarze R2A, następnie przeniesiony do buforu odżywczego Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) i mieszany przez 24 godziny przy 130 obrotach na minutę (U/min) w temperaturze 37°C, a następnie ponownie przeniesiony do TSB (0,3 g/l) w zestawie CDC-Biofilmreaktor z czystymi i rougingowymi płytami (2, 3). Hodowla w biofilmie była mieszana przez 24 godziny przy 125 U/min w temperaturze otoczenia lub pokojowej (RT). Po pierwszych 24 godzinach hodowla była uzupełniana świeżymi mediami (TSB 0,3 g/l) z przepływem 11,7 ml/min.

Skuteczność mikrobiologiczna:

Po inkubacji płyty zostały wyjęte, najpierw zanurzone w sterylnej dejonizowanej wodzie (DI), a następnie umieszczone w sterylnej płytce Petriego. Każda płyta została umieszczona w konicznym 50 ml probówce do centrifugowania. Na podstawie metody pojedynczej rurki ASTM testowano formułowany alkaliczny środek czyszczący (zawartość 1%) w temperaturze 60°C. Biofilm utworzony na czystych lub rougingowych płytach był wystawiony na działanie 4 ml roztworu środka czyszczącego. Aby zneutralizować reakcję, do 4 ml roztworu dodano 36 ml zimnego (~4°C) bulionu Letheen z Asolectinem i TWEEN® (LAT) i wymieszano. Każda zneutralizowana płyta była poddana trzem cyklom mieszania po 30 sekund przy maksymalnej prędkości oraz 30-sekundowemu działaniu ultradźwięków. Pobierane próbki poddano seriom rozcieńczeń roztworu reakcyjnego. Rozcieńczone roztwory zostały rozlanie na agar LAT i rozprowadzone, a następnie inkubowane przez 2 dni w temperaturze 37°C.

Test TOC:

Ocena czyszczenia przeprowadzona z użyciem formułowanego alkalicznego środka czyszczącego (zawartość 1%) obejmowała płyty z biofilmem z P. aeruginosa i bez niego, zarówno z rougingiem, jak i bez. Płyty były suszone na powietrzu przez co najmniej 24 godziny przed czyszczeniem. (4) Zabieg polegał na zanurzeniu płyt w 1 litrze, podgrzanym do 30°C i mieszanym przy 300 U/min, środku czyszczącym. Płyty czyszczono przez 5 minut, spłukiwano DI wodą, a następnie wycierano przy użyciu bawełnianych patyczków o niskiej zawartości TOC. Patyczki następnie poddano ultradźwiękom w 40 ml DI wody przez 15 minut i poddano analizie TOC.

Wnioski

Reaktor CDC-Biofilm i wspierające metody ASTM stanowią powtarzalny system standardowy do oceny problematycznego czyszczenia i dezynfekcji w przypadku tworzenia biofilmu. W tym badaniu te standardowe metody zostały połączone z metodologią STERIS do symulacji powierzchni z rougingiem, aby po raz pierwszy stworzyć model stali nierdzewnej z rougingiem, a następnie wykazać ilościowo i jakościowo, że rouging może zwiększać nakład pracy związany z czyszczeniem i dezynfekcją biofilmu.

Kontaminacja biofilmem stanowi istotne wyzwanie dla regularnych procedur czyszczenia i dezynfekcji. Powierzchnie z rougingiem mogą przyspieszać powstawanie zanieczyszczeń powierzchniowych i rozrost biofilmu, a także nasilać odchylenia mikrobiologiczne. Ten efekt synergistyczny może szybko prowadzić do powstawania uporczywych skupisk rougingu i biofilmu, jak pokazano w tej symulacji. Przedstawiony test czyszczenia jednoznacznie wykazuje, że skuteczne czyszczenie, profilaktyka i strategie dezynfekcji są nieodzowne w ramach systematycznej regulacji kontaminacji.

Bibliografia

(1) Hall-Stoodley, L. i Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. i Hamilton, M.A. (2007) Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., i Lopolito, P., (2013) The Use of CDC Biofilm Reactor to Test Cleaning Agents, Poster, Center for Biofilm Engineering Conference, Montana State University, 5.-6. lutego 2013.