Uso del reactor de biopelículas CDC para la limpieza experimental y desinfección de superficies de oxidación en acero inoxidable

Introducción

Los microorganismos existen en instalaciones de proceso como en la naturaleza, pero rara vez como células individuales o en cultivo puro. Más bien, existen como cultivo monocapa o como comunidad de cultivo mixto, compuesta por diferentes microorganismos. Los microorganismos en un biofilm, como por ejemplo las especies de pseudomonas, generalmente están encerrados en una matriz viscosa de sustancias poliméricas extracelulares (EPS), que es crucial para su supervivencia. (1) Las EPS desempeñan un papel fundamental en la tolerancia aumentada a influencias ambientales, agentes antimicrobianos y productos de limpieza, una característica relacionada con la formación de biofilm. Es de vital importancia eliminar las EPS antes de la limpieza o desinfección.

Los equipos de proceso absolutamente limpios serían ideales, pero rara vez son una realidad. Una acumulación de óxido de hierro, conocida como Rouging, ocurre con frecuencia en la fabricación de recipientes, en tuberías de suministro y en muchos otros lugares con presencia de biofilm. El Rouging se produce por oxidación del acero al contacto con soluciones acuosas. La eficacia de los productos de limpieza y biocidas para eliminar el biofilm y desinfectar los equipos puede verse afectada por el Rouging, ya que la rugosidad superficial y las superficies del sustrato aumentan. Ambos efectos pueden conducir a un aumento en las desviaciones microbianas y promover el desarrollo de biofilm.

Propósito

Las superficies de acero inoxidable con Rouging son problemas frecuentes en las instalaciones de proceso en relación con la limpieza y desinfección. En este estudio se investigó el esfuerzo de limpieza y desinfección en placas de acero inoxidable con Rouging, contaminadas con un biofilm causado por P. aeruginosa, en un sistema de reactor de biofilm CDC. La limpieza y desinfección se evaluaron mediante análisis de superficie con carbono orgánico total (TOC), inspección visual de la limpieza y estudio de eficacia microbiana.

Método

Preparación de placas para el reactor de biofilm CDC:

Las placas (láminas) de acero inoxidable 316L se pasivaron durante al menos 60 minutos a 80°C con un detergente con un contenido de ácido del 20% (placas limpias). Una parte de estas placas pasivadas se sumergió durante 7 días en una solución de cloruro de sodio ventilada, que contenía placas de acero de construcción (placas con Rouging). El Rouging preparado puede eliminarse en 10 minutos a 80°C con un detergente con un contenido de ácido del 5%, con movimiento suave.

Formación del biofilm:

Se cultivó P. aeruginosa ATCC® 15442TM durante 24 horas en agar R2A, se transfirió a caldo nutritivo Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) y se agitaron durante 24 horas a 37°C a 130 rpm, luego se transfirieron nuevamente a TSB (0,3 g/l) en el reactor de biofilm CDC con las placas limpias y con Rouging (2, 3). La cultura en el reactor de biofilm se agitó durante 24 horas a 125 rpm a temperatura ambiente o de entorno. Después de las primeras 24 horas, la cultura se renovó con medios frescos (TSB 0,3 g/l) a una tasa de 11,7 ml/min.

Eficacia microbiana:

Tras la incubación, se retiraron las placas, primero se sumergieron en agua deionizada estéril (DI), y luego se colocaron en una placa de Petri estéril. Cada placa se colocó en un tubo de centrifugación cónico de 50 ml. Se probó un detergente alcalino formulado (contenido del 1%) a 60°C mediante el método de tubo individual ASTM. El biofilm formado en las placas limpias o con Rouging se expuso a 4 ml de solución de detergente. Para neutralizar la reacción, se añadieron 36 ml de caldo Letheen frío (~4°C) con lecitina y TWEEN® (LAT) a la solución formulada de 4 ml y se agitó. Cada placa neutralizada se sometió a tres ciclos de agitación de 30 segundos a máxima velocidad y a un tratamiento ultrasónico de 30 segundos. Las muestras tomadas se diluyeron en serie en la solución neutralizada. Las soluciones diluidas se colocaron en agar LAT y se distribuyeron en placas, que se incubaron durante 2 días a 37°C.

Prueba de TOC:

Se evaluó la limpieza con un detergente alcalino formulado (contenido del 1%). Las placas limpias y con Rouging, con y sin biofilm de P. aeruginosa, se dejaron secar al aire durante al menos 24 horas antes de la limpieza. (4) El tratamiento consistió en sumergir las placas en 1 litro de detergente calentado a 30°C y agitado a 300 rpm. Las placas se limpiaron durante 5 minutos, enjuagaron con agua deionizada, y luego se secaron con hisopos de poliéster de bajo contenido de TOC. Los hisopos se sometieron a ultrasonidos en 40 ml de agua deionizada durante 15 minutos y se analizaron para TOC.

Conclusión

El reactor de biofilm CDC y los métodos ASTM complementarios constituyen un sistema estándar reproducible para evaluar los problemas en la limpieza y desinfección en presencia de biofilm. En este estudio, estas metodologías estándar se combinaron con la metodología STERIS para simular superficies con Rouging, creando por primera vez un modelo de acero inoxidable con Rouging, y demostrando de forma cuantitativa y cualitativa que el Rouging puede aumentar el esfuerzo de limpieza y desinfección en presencia de biofilm.

La contaminación por biofilm representa un desafío importante en los procedimientos habituales de limpieza y desinfección. Las superficies con Rouging pueden acelerar la formación de contaminantes superficiales y biofilm, además de intensificar las desviaciones microbianas. Este efecto sinérgico puede generar rápidamente agregados persistentes de Rouging y biofilm, como se muestra en este estudio simulado. La prueba de limpieza presentada aquí demuestra claramente que una limpieza eficiente, el mantenimiento preventivo y las estrategias de desinfección son imprescindibles dentro de una regulación sistemática de la contaminación.

Referencias

(1) Hall-Stoodley, L. y Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Método de prueba estándar para la cuantificación de biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivado con alta cizalladura y flujo continuo usando reactor de biofilm CDC.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. y Hamilton, M.A. (2007) Evaluación comparativa de pruebas de eficacia de desinfectantes de biofilm. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., y Lopolito, P., (2013) Uso del reactor de biofilm CDC para probar agentes de limpieza, Póster, Congreso del Centro de Ingeniería de Biofilms, Universidad Estatal de Montana, 5-6 de febrero de 2013.