Utilizzo del reattore a biofilm CDC per la pulizia sperimentale e la disinfezione delle superfici di ossidazione su acciaio inossidabile

Introduzione 

I microrganismi esistono negli impianti di processo come in natura solo raramente come singole cellule o come colture pure. Esistono piuttosto come colture monoculture o come comunità di colture miste, composte da diversi microrganismi. I microrganismi su un biofilm, come ad esempio le specie di pseudomonadi, sono comunemente racchiusi in una matrice viscosa di sostanze polimeriche extracellulari (EPS), che sono importanti per la sopravvivenza dei microrganismi. (1) Le EPS svolgono un ruolo essenziale nell'aumentata tolleranza agli agenti ambientali, ai mezzi antimicrobici e ai detergenti, una caratteristica collegata alla formazione di biofilm. È di fondamentale importanza rimuovere le EPS prima della pulizia o della disinfezione.

Le apparecchiature di processo assolutamente pulite sarebbero ideali, ma sono raramente una realtà. Un deposito di ossido di ferro chiamato Rouging si verifica frequentemente nella produzione di contenitori, nelle tubazioni di alimentazione e in molti altri luoghi con presenza di biofilm. Il Rouging è causato dall'ossidazione dell'acciaio in contatto con soluzioni acquose. L'efficacia dei detergenti e dei biocidi per la rimozione del biofilm e la disinfezione delle apparecchiature può essere compromessa dal Rouging, poiché la rugosità superficiale e le superfici dei substrati aumentano. Entrambi gli effetti possono portare a un'ulteriore deviazione microbica e favorire lo sviluppo di biofilm.

Scopo

Le superfici in acciaio inossidabile con Rouging sono spesso punti problematici nelle apparecchiature di processo per quanto riguarda la pulizia e la disinfezione. In questo studio è stato esaminato l'impegno richiesto per la pulizia e la disinfezione di lamiere in acciaio inossidabile con Rouging, contaminati da un biofilm causato da P. aeruginosa, in un sistema di reattori CDC per biofilm. La pulizia e la disinfezione sono stati valutati tramite analisi superficiale con carbonio totale organico (TOC), ispezione visiva della purezza e studio di efficacia microbiologica.

Metodo 

Preparazione delle piastre per il reattore CDC per biofilm:

Le piastre (lamine) in acciaio inossidabile 316L sono state passivate per almeno 60 minuti a 80°C con un detergente con contenuto di acido del 20% (lamine pure). Una parte di queste lamelle passivate è stata immersa per 7 giorni in una soluzione di cloruro di sodio aerata, contenente lamiere di acciaio da costruzione (lamine con Rouging). Il Rouging preparato può essere rimosso in 10 minuti a 80°C con un detergente con contenuto di acido del 5%, con leggera agitazione.

Sviluppo del biofilm:

La cultura di P. aeruginosa ATCC® 15442TM è stata coltivata per 24 ore su agar R2A, trasferita in brodo nutritivo Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) e agitata a 130 giri/min per 24 ore a 37°C, quindi trasferita nuovamente nel TSB (0,3 g/l) nel sistema di reattori CDC con le lamelle pure e con quelle con Rouging (2, 3). La coltura nel reattore di biofilm è stata agitata per 24 ore a 125 giri/min a temperatura ambiente o a temperatura ambiente (RT). Dopo le prime 24 ore, la coltura è stata rifornita con nuovi mezzi (TSB 0,3 g/l) a un flusso di 11,7 ml/min.

Efficacia microbiologica:

Dopo l'incubazione, le lamelle sono state rimosse, prima immerse in acqua deionizzata sterile (DI), poi poste in una piastra Petri sterile. Ogni lamella è stata collocata in un tubo di centrifuga conico da 50 ml. È stato testato un detergente alcalino formulato (contenuto dell'1%) a 60°C con il metodo ASTM a singolo tubo. Il biofilm formato sulle lamelle pure o con Rouging è stato esposto a 4 ml di soluzione detergente. Per neutralizzare la reazione, sono stati aggiunti 36 ml di brodo Letheen freddo (~4°C) con Asolectina e TWEEN® (LAT) alla soluzione di 4 ml, mescolando energicamente. Ogni lamella neutralizzata è stata sottoposta a tre cicli di agitazione di 30 secondi alla massima velocità e a un trattamento ultrasonico di 30 secondi. I campioni prelevati sono stati serialmente diluiti e le soluzioni diluite sono state versate su agar LAT, distribuite e incubate a 37°C per 2 giorni.

Test TOC:

È stato valutato il detergente alcalino formulato (contenuto dell'1%). Le lamelle pure e con Rouging, con e senza biofilm di P. aeruginosa, sono state essiccate all'aria per almeno 24 ore prima della pulizia. La procedura prevedeva l'immersione delle lamelle in 1 litro di detergente riscaldato a 30°C e agitato a 300 giri/min. Le lamelle sono state pulite per 5 minuti, risciacquate con acqua deionizzata, quindi tamponate con tamponi di poliestere a basso contenuto di TOC. I tamponi sono stati sottoposti a trattamento ultrasonico in 40 ml di acqua deionizzata per 15 minuti e analizzati per TOC.

Conclusioni 

Il reattore CDC per biofilm e i metodi ASTM di supporto rappresentano un sistema standard riproducibile per valutare le problematiche di pulizia e disinfezione in presenza di formazione di biofilm. In questo studio, queste metodologie standard sono state combinate con la metodologia STERIS per la simulazione di superfici con Rouging, creando per la prima volta un modello di acciaio inossidabile con Rouging e dimostrando quantitativamente e qualitativamente che il Rouging può aumentare l'impegno richiesto per la pulizia e la disinfezione del biofilm.

La contaminazione da biofilm rappresenta una sfida significativa per le procedure di pulizia e disinfezione regolari. Le superfici con Rouging possono accelerare la formazione di contaminazioni superficiali e di biofilm, oltre a intensificare le deviazioni microbiche. Questo effetto sinergico può portare rapidamente alla formazione di aggregati di Rouging/biofilm persistenti, come dimostrato in questo studio simulato. Il test di pulizia presentato dimostra chiaramente che strategie di pulizia efficaci, manutenzione preventiva e disinfezione sono essenziali all’interno di un approccio sistematico alla regolamentazione della contaminazione.

Riferimenti bibliografici 

(1) Hall-Stoodley, L. e Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. e Hamilton, M.A. (2007) Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., e Lopolito, P., (2013) The Use of CDC Biofilm Reactor to Test Cleaning Agents, Poster, Center for Biofilm Engineering Conference, Montana State University, 5.-6. Febbraio 2013.