Použití CDC-biofilmových reaktorů pro zkušební čištění a dezinfekci povrchů s tvorbou rouging na nerezové oceli

Úvod 

Mikroorganismy se v procesních zařízeních i v přírodě vyskytují jen zřídka jako jednotlivé buňky nebo jako čistá kultura. Spíše existují jako monokultura nebo jako smíšená kultura, která se skládá z různých mikroorganismů. Mikroorganismy na biofilmu, například druhy pseudomonád, jsou běžně uzavřeny v slizovité matrici extracelulárních polymerních látek (EPS), které jsou důležité pro přežití mikroorganismů. (1) EPS hrají klíčovou roli při zvýšené toleranci vůči vlivům prostředí, antimikrobiálním prostředkům a čistícím prostředkům, což je vlastnost spojená s tvorbou biofilmu. Je zásadní odstranit EPS před čištěním nebo dezinfekcí.

Absolutně čistá procesní zařízení by byla ideální, ale jsou jen zřídka realitou. Názvem rouging označujeme usazeniny oxidu železa, které se často vyskytují při výrobě nádob, na rozvodných potrubích a na mnoha dalších místech s výskytem biofilmu. Rouging je způsoben oxidací oceli při kontaktu s vodnými roztoky. Účinnost čistících prostředků a biocidů při odstraňování biofilmu a dezinfekci zařízení může být při rougingu narušena, protože se zvyšuje drsnost povrchů a substrátových ploch. Oba tyto účinky mohou vést ke zvýšené mikrobiální odchylce a podpořit vývoj biofilmu.

Cíl

Povrchy z nerezové oceli s rougingem jsou běžně problematickými místy v procesních zařízeních z hlediska čištění a dezinfekce. V této studii byl zkoumán požadavek na čištění a dezinfekci u nerezových plechů s rougingem, na nichž byl vytvořen biofilm způsobený P. aeruginosa v systému CDC-biofilmového reaktoru. Čištění a dezinfekce byly hodnoceny na základě analýzy povrchu s organicky vázaným celkovým uhlíkem (TOC), vizuální kontroly čistoty a mikrobiologické účinnosti.

Metoda 

Příprava disků pro CDC-biofilmový reaktor:

Disky z nerezové oceli 316L byly minimálně 60 minut pasivovány při 80°C pomocí čistého čistícího prostředku s kyselinovým obsahem 20 %. Část těchto pasivovaných disků byla po dobu 7 dnů umístěna do větraného roztoku chloridu sodného, ve kterém se nacházely konstrukční ocelové plechy (s rougingem). Připravený rouging lze odstranit do 10 minut při 80°C pomocí čistícího prostředku s kyselinovým obsahem 5 % při mírném pohybu.

Vývoj biofilmu:

P. aeruginosa ATCC® 15442TM byla kultivována 24 hodin na agaru R2A, převedena do živného roztoku Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) a při 130 ot/min 24 hodin třepána při 37°C, poté byla znovu převedena do TSB (0,3 g/l) v sestaveném CDC-biofilmovém reaktoru s čistými a rougingem postiženými deskami (2, 3). Kultura v biofilmovém reaktoru byla míchána 24 hodin při 125 ot/min při okolní nebo pokojové teplotě (RT). Po prvních 24 hodinách byla kultura doplněna čerstvým médiem (TSB 0,3 g/l) v množství 11,7 ml/min.

Mikrobiální účinnost:

Po inkubaci byly desky vyjmuty, nejprve ponořeny do sterilní deionizované vody (DI), poté položeny do sterilní Petriho misky. Každá deska byla umístěna do konické zkumavky o objemu 50 ml. Pomocí metody ASTM pro jednotlivé trubice byl testován formulovaný alkalický čisticí prostředek (obsah 1 %) při 60°C. Biofilm, který se vytvořil na čistých nebo rougingem postižených deskách, byl vystaven 4 ml roztoku čisticího prostředku. Pro neutralizaci reakce bylo přidáno 36 ml studeného (~4°C) Letheen-bouillonu s Asolectinem a TWEEN® (LAT) do formulovaného 4 ml roztoku a promícháno. Každá neutralizovaná deska byla vystavena třem cyklům míchání po 30 sekundách při maximální rychlosti a ultrazvukové léčbě po 30 sekundách. Odebrané vzorky představují sériové ředění neutralizovaného reakčního roztoku. Ředěné roztoky byly rozlévány na LAT-agar a rozprostřeny, poté inkubovány 2 dny při 37°C.

TOC test:

Hodnoceno bylo čištění formulovaným alkalickým čisticím prostředkem (obsah 1 %). Čisté a rougingem postižené desky s a bez biofilmu P. aeruginosa byly před čištěním minimálně 24 hodin vysušené na vzduchu. (4) Ošetření spočívalo v ponoření desek do 1 l předehřátého na 30°C a míchaného při 300 ot/min čisticího prostředku. Desky byly čištěny po dobu 5 minut, opláchnuty DI-vodou a poté otřeny polyesterovými tampony s nízkým obsahem TOC. Tampony byly poté ultrazvukově ošetřeny po dobu 15 minut ve 40 ml DI-vody a analyzovány na TOC.

Závěr 

CDC-biofilmový reaktor a podpůrné metody ASTM představují reprodukovatelný standardní systém pro hodnocení problematického čištění a dezinfekce při tvorbě biofilmu. V této studii byly tyto standardní metody kombinovány s metodologií STERIS pro simulaci povrchů s rougingem, čímž byl poprvé vytvořen model nerezové oceli s rougingem a následně bylo kvantitativně i kvalitativně prokázáno, že rouging může zvýšit požadavek na čištění a dezinfekci při tvorbě biofilmu.

Kontaminace biofilmem představuje zásadní výzvu při pravidelných čisticích a dezinfekčních postupech. Povrchy s rougingem mohou urychlit vznik povrchových nečistot a tvorbu biofilmu a zesílit mikrobiální odchylky. Tento synergický efekt může rychle vést k tvorbě odolných shluků rougingu a biofilmu, jak bylo demonstrováno v této simulované studii. Tento test čištění jasně dokazuje, že efektivní čištění, preventivní údržba a dezinfekční strategie jsou nezbytné v rámci systematické regulace kontaminace.

Literární odkazy 

(1) Hall-Stoodley, L. a Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standardní zkušební metoda pro kvantifikaci biofilmu Pseudomonas aeruginosa s vysokým třením a kontinuálním prouděním pomocí CDC-biofilmového reaktoru.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. a Hamilton, M.A. (2007) Srovnávací hodnocení testů účinnosti dezinfekčních prostředků na biofilm. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., a Lopolito, P., (2013) Použití CDC-biofilmového reaktoru k testování čisticích prostředků, poster, konference Center for Biofilm Engineering, Montana State University, 5. - 6. února 2013.