Gebruik van de CDC-biofilmreactor voor proefreiniging en desinfectie van rouging-oppervlakken bij roestvrij staal

Inleiding

Micro-organismen bestaan in procesinstallaties zoals in de natuur zelden als afzonderlijke cellen of als zuivere cultuur. Ze bestaan eerder als monocultuur of als gemengde cultuur-gemeenschap, die uit verschillende micro-organismen bestaat. Micro-organismen op een biofilm, zoals bijvoorbeeld de soort Pseudomonas, zijn algemeen gesproken ingesloten in een slijmerige matrix van extracellulaire polymeren (EPS), die essentieel is voor het overleven van de micro-organismen. (1) EPS spelen een belangrijke rol bij de verhoogde tolerantie tegen omgevingsinvloeden, antimicrobiële middelen en reinigingsmiddelen, een kenmerk dat samenhangt met biofilmvorming. Het is van cruciaal belang om de EPS vóór reiniging of desinfectie te verwijderen.

Volledig schone procesapparatuur zou ideaal zijn, maar is slechts zelden realistisch. Een als rouging bekende ijzoxidestapeling komt vaak voor bij de productie van vaten, aan distributieleidingen en op vele andere plaatsen met biofilmvorming. Rouging wordt veroorzaakt door staaloxidatie bij contact met waterige oplossingen. De werkzaamheid van reinigingsmiddelen en biociden voor het verwijderen van biofilm en het desinfecteren van apparatuur kan worden aangetast door rouging, omdat de oppervlakteruwheid en de substratuithoeken toenemen. Beide effecten kunnen leiden tot een versterkte microbiële afwijking en de ontwikkeling van biofilm bevorderen.

Doel

Rauwing-bevuilde roestvrijstalen oppervlakken vormen vaak probleemgebieden in procesinstallaties met betrekking tot reiniging en desinfectie. In deze studie werd de reinigings- en desinfectiewerking onderzocht bij roestvrijstalen platen met rouging die een biofilm veroorzaakte door P. aeruginosa in een CDC-biofilmreactorsysteem. Reiniging en desinfectie werden beoordeeld op basis van een oppervlakteanalyse met organisch gebonden totaal koolstof (TOC), visuele inspectie op reinheid en microbiële werkzaamheidstudies.

Methode

Voorbereiding van platen voor CDC-biofilmreactor:

CDC-platen (bladen) van 316L roestvrij staal werden minimaal 60 minuten bij 80°C passief gemaakt met een reinigingsmiddel met een zuurgehalte van 20% (puur blad). Een deel van deze passief gemaakte platen werd 7 dagen in een geventileerde natriumchloride-oplossing gelegd, waarin bouwstaalplaten aanwezig waren (rouging-bevuilde platen). De voorbereide rouging kan binnen 10 minuten en bij 80°C worden verwijderd met een reinigingsmiddel met een zuurgehalte van 5%, onder lichte beweging.

Ontwikkeling van biofilm:

P. aeruginosa ATCC® 15442TM werd 24 uur gekweekt op R2A-agar, overgebracht in voedingsbouillon Tryptic Soy Broth (TSB) (0,3 g/l) en 24 uur geschud bij 130 U/min bij 37°C, daarna weer overgebracht naar TSB (0,3 g/l) in de samengestelde CDC-biofilmreactor met de zuivere en rouging-bevuilde platen (2, 3). De cultuur in de biofilmreactor werd 24 uur gemengd bij 125 U/min en op kamertemperatuur (RT). Na de eerste 24 uur werd de cultuur aangevuld met verse media (TSB 0,3 g/l) met een doorstroomsnelheid van 11,7 ml/min.

Microbiële werkzaamheid:

Na de incubatie werden de platen verwijderd, eerst in steriel gedemineraliseerd water (DI) gedompeld en vervolgens in een steriele petrischaal gelegd. Elke plaat werd in een conisch 50 ml-centrifugebuis geplaatst. Met de ASTM-eenbuismethode werd een geformuleerd alkalisch reinigingsmiddel (gehalte van 1%) getest bij 60°C. Het op de zuivere of rouging-bevuilde platen gevormde biofilm werd blootgesteld aan 4 ml van de reinigingsmiddeloplossing. Om de reactie te neutraliseren, werden 36 ml koude (~4°C) Letheen-bouillon met Asolectine en TWEEN® (LAT) toegevoegd aan de 4 ml-formulering en geschud. Elke neutraal gemaakte plaat werd onderworpen aan drie cycli van 30 seconden schudden op maximale snelheid en een ultrasone behandeling van 30 seconden. Verworpen monsters werden seriële verdunningen van de neutrale reactieoplossing. De verdunde oplossingen werden op LAT-agar gegoten en uitgeplateerd, en vervolgens 2 dagen bij 37°C geïncubeerd.

TOC-test:

De reiniging met een geformuleerd alkalisch reinigingsmiddel (gehalte van 1%) werd geëvalueerd. De zuivere en rouging-bevuilde platen, met en zonder P. aeruginosa-biofilm, werden minimaal 24 uur voor de reiniging in de lucht gedroogd. (4) De behandeling bestond uit het onderdompelen van de platen in 1 liter, op 30°C voorverwarmd en roerend bij 300 U/min, reinigingsmiddel. De platen werden 5 minuten gereinigd, gespoeld met DI-water en vervolgens afgenomen met polyester-swabs met een lage TOC-waarde. De swabs werden vervolgens 15 minuten in 40 ml DI-water ultrasoon behandeld en op TOC geanalyseerd.

Conclusie

De CDC-biofilmreactor en de ondersteunende ASTM-methoden vormen een reproduceerbaar standaard systeem voor het beoordelen van problematische reiniging en desinfectie bij biofilmvorming. In deze studie werden deze standaardmethoden gecombineerd met de STERIS-methodologie voor het simuleren van rouging-bevuilde oppervlakken, om voor het eerst een model van rouging-bevuild roestvrij staal te creëren en vervolgens kwantitatief en kwalitatief aan te tonen dat rouging de reinigings- en desinfectiewerkzaamheden bij biofilm kan verhogen.

Contaminatie met biofilm vormt een belangrijke uitdaging bij reguliere reinigings- en desinfectiemethoden. Rouging-bevuilde oppervlakken kunnen het ontstaan van oppervlakteverontreinigingen en biofilmvorming versnellen, evenals microbiële afwijkingen versterken. Dit synergie-effect kan snel hardnekkige rouging-/biofilm-aggregaten veroorzaken, zoals in deze gesimuleerde studie. De hier gepresenteerde reinigingstest bewijst ondubbelzinnig dat efficiënte reiniging, preventief onderhoud en desinfectiestrategieën essentieel zijn binnen een systematische regulering van contaminatie.

Literatuurlijst

(1) Hall-Stoodley, L. en Stoodley, P. (2002) Developmental Regulation of Microbial Biofilms. Current Opinion in Biotechnology. 13:228-233.

(2) ASTM E2562 – 12 Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.

(3) Buckingham-Meyer, K., Goeres, D.M. en Hamilton, M.A. (2007) Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70: 236-244.

(4) Dell’Aringa, B., Deal, A., Klein, D., en Lopolito, P., (2013) The Use of CDC Biofilm Reactor to Test Cleaning Agents, Poster, Center for Biofilm Engineering Conference, Montana State University, 5. - 6. Febr. 2013.