Tri automatisé à haut débit de cellules vivantes par lumière laser et intelligence artificielle

Sphéroïde de fibroblastes 3T3 coloré à l'actine pour le transfert LIFT, cultivé dans des microcuvettes fabriquées au laser. © Fraunhofer ILT, Aachen / Sphéroïde de fibroblastes 3T3 coloré à l'actine pour le transfert LIFT, cultivé dans des microcuvettes fabriquées au laser. © Fraunhofer ILT, Aachen, Allemagne

Le LIFTOSCOPE combine la microscopie à grande vitesse, l'analyse basée sur l'IA et la localisation de cellules vivantes et de groupes cellulaires avec le transfert direct par laser (LIFT). Le faisceau laser est couplé directement dans le trajet optique du microscope via des miroirs. Les utilisateurs peuvent passer de l'observation par caméra au processus LIFT. © Fraunhofer ILT, Aachen, Allemagne

La procédure MIR LIFT transfère des cellules vivantes sur des plaques de microtitration (MTP) à un débit élevé pouvant atteindre 100 Hz, successivement. Afin d'intégrer ce processus hautement efficace dans des plateformes de microscopie indépendamment du fabricant, le Fraunhofer ILT a notamment développé le support présenté ici pour une MTP à six puits. © Fraunhofer ILT, Aachen / La procédure MIR LIFT transfère des cellules vivantes vers des plaques de microtitration (MTP) une après l'autre à une vitesse élevée pouvant atteindre 100 Hz. Afin d'intégrer ce processus très efficace dans des plateformes de microscopie, quel que soit le fabricant, le Fraunhofer ILT a notamment développé, entre autres, le support montré ici pour une MTP à six puits. © Fraunhofer ILT, Aachen, Allemagne

Des chercheurs du Fraunhofer ILT testent le LIFTOSCOPE pour le tri automatisé à haut débit de cellules vivantes assisté par intelligence artificielle, utilisant un rayonnement laser pulsé. © Fraunhofer ILT, Aachen / Researchers at Fraunhofer ILT are testing the LIFTOSCOPE for AI-assisted, fully automated high-throughput sorting of living cells by pulsed laser radiation. © Fraunhofer ILT, Aachen, Germany

Les tests sur des cultures cellulaires vivantes deviennent de plus en plus importants pour la médecine personnalisée, le développement de médicaments et la recherche clinique. Une nouvelle méthode à haut débit assistée par intelligence artificielle (IA) développée par les instituts Fraunhofer pour la technologie laser ILT et pour la technologie de production IPT d'Aix-la-Chapelle permet d'isoler automatiquement des types cellulaires spécifiques. Avec le système appelé LIFTOSCOPE, les laboratoires peuvent localiser, identifier, mesurer la taille et analyser des dizaines de cellules vivantes par seconde, afin de les transférer par laser (Laser-Induced Forward Transfer, LIFT) dans des microplaques.

Les cellules souches pluripotentes sont la clé de la médecine personnalisée. Lorsqu'il est possible de les isoler à partir d'échantillons de sang ou de tissus, il devient possible de reproduire différents types cellulaires de divers tissus. Ces cultures cellulaires permettent des tests individuels de médicaments et d'intolérances hors du corps, et constituent un outil précieux dans le développement de thérapies hautement spécifiques et personnalisées. Cependant, pour établir le traitement personnalisé en routine clinique, il faut des procédés efficaces pour isoler les cellules souches pluripotentes. Par ailleurs, la recherche pharmaceutique cherche également des méthodes pour séparer les cellules à haute productivité destinées au développement de médicaments à partir de cultures polyclonales, puis les transférer dans des cultures monocloniques, sans compromettre leur vitalité ou leur capacité de division. Les hôpitaux ont également dû constater pendant la pandémie que les procédés disponibles pour l'isolation et l'analyse des cellules (immuno-)provenant de patients atteints devaient faire face à des limites de capacité.

Les instituts Fraunhofer ILT et IPT présenteront lors du salon mondial de la technologie de laboratoire, de l'analyse et de la biotechnologie, analytica ’24 (du 9 au 12 avril 2024), un appareil qui, grâce à une tri et une isolation cellulaires entièrement automatisées, permet une augmentation significative de l'efficacité. Le LIFTOSCOPE intègre un processus à haut débit assisté par IA dans un microscope inversé commercial, équipé d'une caméra à haute vitesse et d'une source de lumière flash. Pour identifier les cellules en microsecondes et les transférer sur des microplaques avec des taux de survie supérieurs à 90 %, le LIFTOSCOPE combine trois processus de haute technologie en un seul appareil.

Avec l'IA et le laser vers une sélection cellulaire entièrement automatisée

L'équipe de projet a intégré directement dans le trajet optique du microscope le processus MIR LIFT, développé et breveté par le Fraunhofer ILT. Un système de caméras associé fournit cent images haute résolution par seconde. Sur la base de ces données d'image, l'IA développée par le Fraunhofer IPT identifie, par segmentation sémantique, les types cellulaires recherchés. L'IA peut être entraînée à reconnaître aussi bien les cellules souches pluripotentes que les cellules à haute productivité ou les cellules immunitaires. De plus, l'IA détermine la position exacte et les points focaux des cellules. Lors de la procédure MIR LIFT, elles sont transférées, à raison de jusqu'à 100 Hz, une par une sur une microplaque. « Selon le type cellulaire, jusqu'à 100 % des cellules peuvent survivre à cette procédure », explique le Dr Nadine Nottrodt, responsable du groupe de biofabrication, qui supervise ce projet commun avec le chef de projet Richard Lensing.

La méthode LIFT elle-même est étonnamment simple. Un laser de neuf nanosecondes de courte durée, avec une énergie de quelques microjoules, suffit à provoquer la formation d'une bulle de vapeur dans le liquide situé juste en dessous de la cellule ciblée. La cellule, préalablement dissoute enzymatiquement de son environnement, est brièvement soulevée par la bulle. Dès que la bulle se collapsse, un effet de succion se crée, aspirant la cellule dans le récipient de culture de la microplaque. « Les cellules dans les échantillons sont distribuées aléatoirement. Notre système parcourt un réseau prédéfini et transfère les cellules situées dans un rayon de 50 micromètres autour du point focal », explique Lensing. Le LIFTOSCOPE peut ainsi piloter précisément, dans un processus laser optiquement surveillé, le transfert des cellules. Si nécessaire, le processus peut être combiné avec des marqueurs fluorescents pour identifier des cellules spécifiques. Mais même sans additifs, la méthode fonctionne de manière robuste. Deux raisons expliquent cela : d'une part, la localisation précise assurée par l'IA garantit que les cellules sont bien capturées par le jet et transférées dans la microplaque. D'autre part, le Fraunhofer ILT a réussi, grâce à un développement continu, à éliminer les absorbeurs métalliques initialement nécessaires dans le processus. En utilisant un laser infrarouge moyen de 2940 nanomètres, l'eau présente dans le système est directement excitée, tandis que les polymères des supports d'échantillons absorbent peu ou pas cette longueur d'onde.

Mouvement continu versus processus stop-and-go

L'objectif de l'équipe de projet est de pérenniser la détection entièrement automatisée des cellules et le processus LIFT afin d'assurer un débit élevé, en limitant le temps total pour traiter une microplaque à dix minutes. Cela nécessite une actuation très précise pour l'imagerie et le positionnement du point focal laser dans le cycle du processus. Cette précision garantit d'une part la résolution d'image nécessaire à la détection et à la mesure des cellules assistée par IA, et d'autre part un positionnement du point focal laser à 25 micromètres de précision juste en dessous de la cellule. Le transfert d'une seule cellule s'achève en 200 microsecondes. Avec le LIFTOSCOPE, il est possible de piloter et de transférer 10 000 cellules sur des microplaques en 100 secondes.

L'équipe du Fraunhofer a exploré deux stratégies différentes pour le déplacement de la culture cellulaire. « En mode stop-and-go, il faut prévoir une courte phase de repos avant et après le transfert de chaque cellule, car chaque arrêt génère des écoulements hydrodynamiques dans l'échantillon, qui doivent se calmer avant le transfert suivant », explique Nottrodt. Bien que cette stratégie permette de trier des échantillons contenant de nombreuses cellules différentes et réduise la charge de préparation des échantillons, les pauses diminuent l'efficacité. Dans le processus continu, la deuxième approche, le LIFTOSCOPE déplace le support d'échantillons selon un réseau défini, pouvant comporter jusqu'à 1600 lignes espacées de 50 micromètres, et transfère chaque cellule qui se trouve dans le point focal lors de cette marche continue. L'avantage temporel de cette méthode augmente avec le nombre de cellules transférées. Dès 10 000 cellules, le processus continu est plus de deux fois plus rapide, et à 100 000 cellules, il l'est déjà vingt fois plus que le mode stop-and-go.

La nouvelle méthode basée sur l'IA et le laser ouvre la voie à une isolation automatisée, très efficace, de cellules vivantes. Selon Nottrodt, le déroulement actuel du projet montre qu'une synchronisation du transfert cellulaire avec la fréquence d'image de la caméra à haute vitesse — permettant une triage d'une centaine de cellules par seconde — est réalisable. La prochaine étape consiste à faire évoluer cette méthode prototype vers une version prête pour le marché. « Les intéressés peuvent venir découvrir le LIFTOSCOPE lors du stand commun de la Fraunhofer-Gesellschaft à la Halle A3/407 lors d'analytica 2024 », invitent Nottrodt et Lensing. En regardant le potentiel de la médecine personnalisée, il serait souhaitable que cette technologie trouve rapidement sa place dans la pratique médicale, pharmaceutique et clinique.