Automatizované vysokovýkonné třídění živých buněk pomocí laserového světla a AI

Aktinově barvený 3T3 fibroblastový sfér, určený pro přenos LIFT, pěstovaný v laserem vyrobených mikropodložkách. © Fraunhofer ILT, Aachen / Aktinově barvený 3T3 fibroblastový sfér pro přenos LIFT, pěstovaný v laserem vyrobených mikropodložkách. © Fraunhofer ILT, Aachen, Německo

LIFTOSCOPE spojuje vysokorychlostní mikroskopii, analýzu a lokalizaci živých buněk a buněčných shluků s laserem indukovaným přenosovým procesem (LIFT). Laserový paprsek je přímo připojen přes zrcadla do paprskové dráhy mikroskopu. Uživatelé mohou přepínat mezi pozorováním kamerou a procesem LIFT. © Fraunhofer ILT, Aachen

Metoda MIR LIFT přenáší živé buňky s vysokou rychlostí až 100 Hz postupně na mikrotitrační destičky (MTP). Aby bylo možné tento vysoce efektivní proces integrovat do mikroskopických platforem bez ohledu na výrobce, vyvinul Fraunhofer ILT mimo jiné držák zobrazený zde pro šestidílnou MTP. © Fraunhofer ILT, Aachen, Německo

Výzkumníci z Fraunhofer ILT testují LIFTOSCOPE pro AI-podporované, plně automatizované vysokokapacitní třídění živých buněk pomocí pulzního laserového záření. © Fraunhofer ILT, Aachen / Výzkumníci z Fraunhofer ILT testují LIFTOSCOPE pro AI-podporované, plně automatizované vysokokapacitní třídění živých buněk pomocí pulzního laserového záření. © Fraunhofer ILT, Aachen, Německo

Testy živých buněčných kultur jsou stále důležitější pro personalizovanou medicínu, vývoj léčiv a klinický výzkum. Nový AI-řízený vysokovýkonný proces od Fraunhoferových ústavů v Aachenu, ILT a IPT, umožňuje automatizovanou izolaci specifických typů buněk. S takzvaným LIFTOSCOPE mohou laboratoře lokalizovat, identifikovat a měřit jejich velikost a soustředění desítky živých buněk za sekundu a analyzovat je, aby je pomocí laserem indukovaného forward transferu (LIFT) přenesly do mikrotitračních destiček.

Pluripotentní kmenové buňky jsou klíčem k personalizované medicíně. Pokud se podaří je izolovat z krevních a tkáňových vzorků, lze z nich napodobit různé typy buněk z různých tkání. Tyto buněčné kultury umožňují individuální testy účinnosti a nesnášenlivosti léčiv mimo tělo a jsou cenným nástrojem při vývoji vysoce specifických personalizovaných terapií. Aby však bylo možné zavést personalizovanou léčbu do klinické praxe, je třeba efektivních metod pro izolaci pluripotentních kmenových buněk. Kromě toho hledá farmaceutický výzkum způsoby, jak separovat tzv. high-producer buňky pro vývoj léčiv z polyklonálních kultur a přenést je do monoklonálních kultur, aniž by došlo ke snížení vitality nebo schopnosti dělení buněk. Kliniky si také během pandemie uvědomily, že dostupné metody izolace a analýzy (imun-) buněk z pacientských vzorků dosahují kapacitních limitů.

Fraunhoferovy ústavy ILT a IPT představí na světové výstavě pro laboratorní techniku, analytiku a biotechnologie analytica ’24 (9. až 12. dubna 2024) zařízení, které díky plně automatizované třídění a izolaci buněk přináší výrazné zvýšení efektivity. LIFTOSCOPE integruje AI-řízený vysokovýkonný proces do běžného reverzního mikroskopu, který je vybaven vysokorychlostní kamerou a bleskovým zdrojem světla. Aby bylo možné identifikovat buňky během mikrosekund a přenést je s přežitím nad 90 procent na mikrotitrační destičky, spojuje LIFTOSCOPE tři špičkové technologie v jednom zařízení.

S AI a laserem k plně automatizované selekci buněk

Výzkumný tým integroval patentovaný proces MIR LIFT, vyvinutý na Fraunhofer ILT, přímo do optického paprsku mikroskopu. Připojený kamerový systém poskytuje stovky vysokorozlišovacích snímků za sekundu. Na základě těchto obrazových dat identifikuje AI vyvinutá na Fraunhofer IPT požadované typy buněk pomocí sémantické segmentace. AI může být trénována na rozpoznávání pluripotentních kmenových buněk, high-producer buněk nebo imunitních buněk. Navíc určuje přesnou pozici a soustředění buněk. V procesu MIR LIFT jsou buňky poté přenášeny jedna po druhé s frekvencí až 100 Hz na mikrotitrační destičku. »Podle typu buňky přežije až 100 procent všech buněk tuto proceduru«, vysvětluje Dr. Nadine Nottrodt, vedoucí skupiny biofabrikace, která tento společný vývojový projekt na straně Fraunhofer ILT doprovází spolu s projektovým vedoucím Richardem Lensingem.

Sám proces LIFT je překvapivě jednoduchý. Laserpulz o délce devíti nanosekund s několika mikrojouly pulzní energie stačí k tomu, aby přímo pod cílovou buňkou vyvolal tvorbu páry. Buňka, dříve enzymaticky uvolněná ze svého svazku, je krátce zvednuta parou. Jakmile parní bublina kolabuje, vznikne podtlak, který vtáhne buňku do kultivační nádoby mikrotitrační destičky. »Vzorky jsou náhodně rozloženy. Proto náš systém prochází předem definovanou mřížkou a přenáší buňky, které se nacházejí v okruhu 50 mikrometrů od ohniskového bodu«, vysvětluje Lensing. Tam může LIFTOSCOPE přesně ovládat a přenášet buňky v tomto vysoce přesném laserovém procesu, který je opticky monitorován. Pokud je třeba, lze proces LIFT kombinovat s fluorescenčními markery k identifikaci specifických buněk. I bez přídavných látek je však metoda robustní. Důvody jsou dva: Za prvé, přesná lokalizace pomocí AI zajišťuje, že buňky jsou skutečně zachyceny proudem a přeneseny do mikrotitračních destiček. Za druhé, Fraunhofer ILT díky kontinuálnímu vývoji procesu LIFT dokázal eliminovat zpočátku potřebné kovové absorbéry. Pomocí střední infračervené laserové technologie s vlnovou délkou 2940 nanometrů je nyní přímo aktivována voda v systému, zatímco polymery vzorkovacích nádob tyto vlnové délky téměř neabsorbuji.

Kontinuální pohyb versus zastávka a rozjezd

Cílem výzkumného týmu je stabilizovat plně automatizované rozpoznávání buněk a proces LIFT s cílem vysoké průchodnosti a celková doba zpracování celé mikrotitrační destičky by měla být omezena na deset minut. To vyžaduje velmi přesnou aktivaci pro obrazovou i polohovou přesnost laserového fokusu v rámci procesu. Tato přesnost zajišťuje jak požadované rozlišení obrazu pro AI-řízené rozpoznávání a měření buněk, tak i přesné umístění laserového fokusu do 25 mikrometrů přímo pod buňkou. Přenos jedné buňky je hotov do 200 mikrosekund. Za 100 sekund lze s LIFTOSCOPEm ovládat a přenést 10 000 buněk na mikrotitrační destičky.

Fraunhoferův tým sledoval dvě různé strategie pohybu buněčné kultury. »V režimu zastávka a rozjezd je třeba před a po procesu LIFT krátce zastavit, protože každý zastávka vyvolá hydrodynamické proudy v vzorku, které se před dalším přenosem buněk musí uklidnit«, uvádí Nottrodt. Ačkoliv tato strategie umožňuje třídění vzorků s mnoha různými buňkami a snižuje nároky na přípravu vzorků, má však nevýhodu v nižší efektivitě. Ve kontinuálním procesu, druhém přístupu, pohybuje LIFTOSCOPE vzorkovacími nosiči v mřížce, která je definována podle požadovaného typu buňky, s až 1600 liniemi vzdálenými 50 mikrometrů – a v tomto plynulém pohybu přenáší každou buňku, která se dostane do ohniska. Časová výhoda této metody roste s počtem přenesených buněk. U 10 000 buněk je kontinuální proces více než dvojnásobně rychlejší, u 100 000 buněk je již 20krát rychlejší než režim zastávka a rozjezd.

Nová AI- a laserová technologie ukazuje cestu k plně automatizované, vysoce efektivní izolaci živých buněk. Podle Nottrodt ukazuje dosavadní průběh projektu, že synchronizace procesu LIFT s frekvencí snímání vysokorychlostní kamerou – a tím i třídění jednotlivých buněk při 100 buňkách za sekundu – je možná. Dalším krokem je vývoj prototypové metody do fáze komerčního využití. »Zájemci se mohou na společném stánku Fraunhoferovy společnosti v hale A3/407 na analytice 2024 podrobněji seznámit s LIFTOSCOPE«, zvou Nottrodt a Lensing. S ohledem na potenciál personalizované medicíny je žádoucí, aby se tato technologie rychle dostala do lékařské, farmaceutické a klinické praxe.