Geautomatiseerde high-throughput sortering van levende cellen met laserlicht en AI

Actine gekleurde 3T3 fibroblastenspheroid voor de LIFT-overdracht, gekweekt in lasergefabricieerde microwells. © Fraunhofer ILT, Aachen / Actine gekleurde 3T3 fibroblastenspheroid voor LIFT-overdracht, gekweekt in lasergefabricieerde microwells. © Fraunhofer ILT, Aachen, Duitsland

De LIFTOSCOPE combineert hoogsnelheid-microscopie, AI-gebaseerde analyse en lokalisatie van levende cellen en celclusters met laser-geïnduceerde voorwaartse overdracht (LIFT). De laserstraal wordt via spiegels rechtstreeks in het stralingspad van het microscoop gekoppeld. Gebruikers kunnen schakelen tussen camerabeeld en het LIFT-proces. © Fraunhofer ILT, Aken

Het MIR LIFT-proces transporteert levende cellen achtereenvolgens op microtiterplaten (MTP) met een hoge snelheid tot wel 100 Hz. Om het uiterst efficiënte proces fabrikantonafhankelijk in microscopenplatformen te integreren, heeft het Fraunhofer ILT onder andere de hier afgebeelde houder ontwikkeld voor een 6-well MTP. © Fraunhofer ILT, Aken / Het MIR LIFT-proces transporteert levende cellen achtereenvolgens naar microtiterplaten (MTP) met een hoge snelheid tot 100 Hz. Om het zeer efficiënte proces in microscopenplatformen te integreren, ongeacht de fabrikant, heeft het Fraunhofer ILT onder andere de hier afgebeelde houder ontwikkeld voor een zes-well MTP. © Fraunhofer ILT, Aken, Duitsland

Onderzoekers van het Fraunhofer ILT testen de LIFTOSCOPE voor AI-ondersteunde, volledig geautomatiseerde high-throughput sortering van levende cellen met gepulseerde laserstraling. © Fraunhofer ILT, Aken / Researchers at Fraunhofer ILT are testing the LIFTOSCOPE for AI-assisted, fully automated high-throughput sorting of living cells by pulsed laser radiation. © Fraunhofer ILT, Aachen, Duitsland

Tests op levende celkweken worden steeds belangrijker voor gepersonaliseerde geneeskunde, geneesmiddelenontwikkeling en klinisch onderzoek. Een nieuw KI-gestuurd high-throughput systeem van de Fraunhofer-instituten voor Lasertechniek ILT en voor Productietechnologie IPT maakt het mogelijk om specifieke celtypen geautomatiseerd te isoleren. Met het zogenaamde LIFTOSCOPE kunnen laboratoria tientallen levende cellen per seconde lokaliseren, identificeren, evenals hun grootte en clusters meten en analyseren, om ze via Laser-Induced Forward Transfer (LIFT) in microtiterplaten over te brengen.

Pluripotente stamcellen zijn de sleutel tot gepersonaliseerde geneeskunde. Als het lukt om ze uit bloed- en weefselmonsters te isoleren, kunnen verschillende celtypen van diverse weefselsoorten worden nagebootst. Deze celkweken maken individuele geneesmiddelen- en intolerantietests buiten het lichaam mogelijk en vormen een waardevol instrument bij de ontwikkeling van zeer specifieke, gepersonaliseerde therapieën. Maar om gepersonaliseerde behandelingen in de klinische routine te integreren, zijn efficiënte methoden nodig voor het isoleren van pluripotente stamcellen. Daarnaast zoekt de farmaceutische industrie naar methoden om zogenaamde high-producer cellen voor geneesmiddelenontwikkeling te scheiden uit polyklonale culturen en in monoklonale culturen over te brengen, zonder de vitaliteit of delingscapaciteit van de cellen te schaden. Ook klinieken moesten tijdens de pandemie erkennen dat de beschikbare methoden voor isolatie en analyse van (immun-)cellen uit patiëntmonsters hun laboratoria aan de capaciteitsgrenzen brengen.

De Fraunhofer-instituten voor Lasertechniek ILT en voor Productietechnologie IPT presenteren op de wereldleidende beurs voor laboratoriumtechniek, analyse en biotechnologie, analytica ’24, (9 tot 12 april 2024) een apparaat dat dankzij volledig geautomatiseerde cel sortering en isolatie zorgt voor een aanzienlijke efficiëntieverbetering. Het LIFTOSCOPE integreert een KI-gestuurd high-throughput proces in een gangbare inversmicroscoop, uitgerust met een high-speed camera en een flitslichtbron. Om cellen binnen microseconden te identificeren en met overlevingskansen van meer dan 90 procent over te brengen op microtiterplaten, verenigt het LIFTOSCOPE drie hightech-processen in één apparaat.

Met KI en laser naar volledig geautomatiseerde cellenselectie

Het projectteam heeft het door Fraunhofer ILT ontwikkelde, patentbeschermde MIR LIFT-proces direct geïntegreerd in de lichtbaan van de microscoop. Een daaraan gekoppeld camerasysteem levert honderd hoogresolutiebeelden per seconde. Op basis van semantische segmentatie identificeert de door Fraunhofer IPT ontwikkelde KI de gewenste celtypen in deze beeldgegevens. De KI kan hiervoor getraind worden op het herkennen van pluripotente stamcellen, evenals van high-producer cellen of immunecellen. Daarnaast bepaalt de KI de exacte positie en clusters van de cellen. In het MIR LIFT-proces worden ze vervolgens met snelheden tot 100 Hertz één voor één overgebracht naar een microtiterplaat. »Afhankelijk van het celtype overleven tot wel 100 procent van de cellen deze procedure«, legt Dr. Nadine Nottrodt uit, groepsleider Biofabriek, die het gezamenlijke ontwikkelingsproject namens Fraunhofer ILT samen met projectleider Richard Lensing begeleidt.

Het LIFT-proces zelf is bijzonder eenvoudig. Een laserpuls van negen nanoseconden met enkele microjoules pulsenergie is voldoende om het vloeibare medium direct onder de doelcel te stimuleren tot het vormen van een dampbel. De eerder enzymatisch uit de verbinding losgemaakte cel wordt kort door de bel omhoog gedrukt. Zodra de bel instort, ontstaat er een zuigkracht die de cel in het cultuurvat van de microtiterplaat zuigt. »De cellen zijn in de monsters willekeurig verdeeld. Daarom beweegt ons systeem een vooraf ingesteld raster af en transferreert cellen die zich binnen een straal van 50 micrometer rond het focuspunt bevinden«, legt Lensing uit. Daar kan het LIFTOSCOPE de cellen in het uiterst precieze, optisch gecontroleerde laserproces exact aansturen en overbrengen. Indien nodig kan het LIFT-proces worden gecombineerd met fluorescerende markers om specifieke cellen te identificeren. Maar ook zonder additieven werkt de methode robuust. Dit heeft twee redenen: enerzijds garandeert de nauwkeurige lokalisatie door de KI dat de cellen daadwerkelijk door de jet worden geraakt en in de microtiterplaten worden gebracht. Anderzijds is het Fraunhofer ILT dankzij voortdurende verdere ontwikkeling van het LIFT-proces gelukt om de aanvankelijk benodigde metalen absorbers uit het proces te elimineren. Door gebruik te maken van een mid-infrarood laser met een golflengte van 2940 nanometer wordt nu het water dat al in het systeem aanwezig is direct gestimuleerd, terwijl de polymeren van de monsters geen of nauwelijks deze golflengte absorberen.

Continu beweging versus stop-and-go-proces

Het doel van het projectteam is om de volledig geautomatiseerde celherkenning en het LIFT-proces te verduurzamen voor hoge doorvoersnelheden en de totale procestijd voor een volledige microtiterplaat te beperken tot tien minuten. Dit vereist voor de beeldvorming en de positionering van de laserfocus in de procescyclus een uiterst precieze actuator. Hiermee wordt enerzijds de benodigde beeldresolutie voor KI-gestuurde celherkenning en -meting gegarandeerd en anderzijds de op 25 micrometer nauwkeurige positionering van de laserfocus direct onder de cel. Binnen 200 microseconden is een enkele cel overgebracht. Met het LIFTOSCOPE kunnen in 100 seconden 10.000 cellen worden aangestuurd en overgebracht naar de microtiterplaten.

Het Fraunhofer-team heeft twee verschillende strategieën voor de beweging van de celkweek gevolgd. »In de stop-and-go-werking is het nodig om vóór en na het cel-LIFT een korte rustfase in te lassen, omdat elke stop hydrodynamische stromingen in het monster veroorzaakt die eerst moeten kalmeren voordat de volgende cel kan worden overgebracht«, vertelt Nottrodt. Hoewel deze strategie het sorteren van monsters met veel verschillende cellen mogelijk maakt en de voorbereidingstijd verlaagt, gaat dit ten koste van de efficiëntie. Bij de continue methode, de tweede aanpak, beweegt het LIFTOSCOPE de monsters in een raster van maximaal 1600 lijnen met 50 micrometer afstand, afhankelijk van het gewenste celtype, en brengt in deze voortdurende beweging elke cel die in het focusgebied komt over. Het tijdsvoordeel van deze methode groeit naarmate meer cellen worden overgebracht. Bij 10.000 overgebrachte cellen is het proces meer dan twee keer zo snel, bij 100.000 cellen al twintig keer sneller dan de stop-and-go-werkwijze.

De nieuwe KI- en laser-gebaseerde methode wijst de weg naar een volledig geautomatiseerde, zeer efficiënte isolatie van levende cellen. Volgens Nottrodt toont de huidige projectstatus aan dat een synchronisatie van het cel-LIFT met de beeldfrequentie van de highspeed-camera – en daarmee een individuele cellen sortering van 100 cellen per seconde – haalbaar is. In de volgende stap wordt gewerkt aan het ontwikkelen van de prototype-methode tot een marktklare oplossing. »Geïnteresseerden kunnen zich op de gezamenlijke stand van de Fraunhofer-Gesellschaft in hal A3/407 van analytica 2024 graag een beter beeld vormen van de LIFTOSCOPE«, nodigen Nottrodt en Lensing uit. Met het oog op het potentieel van gepersonaliseerde geneeskunde is het wenselijk dat deze technologie snel haar weg vindt naar de medische, farmaceutische en klinische praktijk.