Automatyczna wysokoprzepustowa sortowanie żywych komórek za pomocą światła laserowego i sztucznej inteligencji

Sferoid fibroblastów 3T3 z barwionym aktyną do transferu LIFT, hodowany w mikronaczyniach wyciętych laserowo. © Fraunhofer ILT, Aachen / Actin-stained 3T3 fibroblast spheroid for LIFT transfer, cultivated in laser-fabricated microwells. © Fraunhofer ILT, Aachen, Niemcy

LIFTOSCOPE łączy mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, analizę opartą na sztucznej inteligencji oraz lokalizację żywych komórek i skupisk komórek z laserowym transferem do przodu (LIFT). Strumień laserowy jest bezpośrednio wprowadzany do toru wiązki mikroskopu za pomocą luster. Użytkownicy mogą przełączać się między obserwacją kamerą a procesem LIFT. © Fraunhofer ILT, Aachen, Niemcy

Metoda MIR LIFT przenosi żywe komórki z wysoką częstotliwością do 100 Hz kolejno na mikroplaty (MTP). Aby móc niezależnie od producenta zintegrować ten wysoce wydajny proces z platformami mikroskopowymi, Fraunhofer ILT opracowało m.in. przedstawiony tutaj uchwyt do sześciokomorowej mikroplaty (6-Well MTP). © Fraunhofer ILT, Aachen

Naukowcy z Fraunhofer ILT testują LIFTOSCOPE do wspomaganej sztuczną inteligencją, w pełni zautomatyzowanej wysokoprzepustowej sortowania żywych komórek za pomocą impulsowego promieniowania laserowego. © Fraunhofer ILT, Aachen / Researchers at Fraunhofer ILT are testing the LIFTOSCOPE for AI-assisted, fully automated high-throughput sorting of living cells by pulsed laser radiation. © Fraunhofer ILT, Aachen, Germany

Testy na żywych kulturach komórkowych stają się coraz ważniejsze dla medycyny spersonalizowanej, rozwoju leków i badań klinicznych. Nowa, oparta na sztucznej inteligencji, metoda wysokoprzepustowa opracowana przez aachenowskie instytuty Fraunhofer ILT i IPT umożliwia automatyczną izolację określonych typów komórek. Dzięki tak zwanej technologii LIFTOSCOPE laboratoria mogą lokalizować, identyfikować oraz mierzyć i analizować ich rozmiar i skupiska setek żywych komórek na sekundę, a następnie transferować je za pomocą laserowego zjawiska Forward Transfer (LIFT) na mikroplaty.

Komórki macierzyste pluripotentne są kluczem do medycyny spersonalizowanej. Jeśli uda się je wyizolować z próbek krwi i tkanek, można na ich podstawie odtworzyć różne typy komórek tkanek. Te kultury komórkowe umożliwiają indywidualne testy skuteczności leków i nietolerancji poza organizmem, stanowiąc cenne narzędzie w rozwoju bardzo specyficznych terapii spersonalizowanych. Jednak aby wprowadzić spersonalizowane leczenie do rutynowej praktyki klinicznej, potrzebne są wydajne metody izolacji komórek macierzystych pluripotentnych. Ponadto, branża farmaceutyczna poszukuje metod separacji tzw. komórek wysokoprodukcyjnych do rozwoju leków z kultur poliklonalnych i transferowania ich do kultur monoklonalnych, bez uszczerbku dla ich żywotności czy zdolności do podziałów. Szpitale musiały również w czasie pandemii zauważyć, że dostępne metody izolacji i analizy (immuno-)komórek z próbek pacjentów osiągają granice swoich możliwości laboratoryjnych.

Instytuty Fraunhofer ILT i IPT zaprezentują na światowej wystawie wiodącej w branży techniki laboratoryjnej, analityki i biotechnologii, analytica ’24 (9-12 kwietnia 2024), urządzenie, które dzięki w pełni zautomatyzowanemu sortowaniu i izolacji komórek zapewnia znaczący wzrost wydajności. LIFTOSCOPE integruje proces wysokoprzepustowy wspomagany sztuczną inteligencją z typowym mikroskopem odwrotnym, wyposażonym w kamerę o dużej prędkości i źródło błyskowego światła. Aby identyfikować komórki w mikrosekundach i transferować je na mikroplaty z wskaźnikami przeżywalności powyżej 90 procent, LIFTOSCOPE łączy w jednym urządzeniu trzy zaawansowane technologie.

Z AI i laserem do w pełni automatycznego wyboru komórek

Zespół projektowy zintegrował opracowany na Fraunhofer ILT patentowany proces MIR LIFT bezpośrednio w tor wiązki mikroskopu. Do tego systemu podłączony jest system kamer, który dostarcza sto wysokorozdzielczych obrazów na sekundę. Na podstawie tych danych obrazowych sztuczna inteligencja opracowana na Fraunhofer IPT rozpoznaje poszukiwane typy komórek, korzystając z techniki segmentacji semantycznej. AI może być trenowana do rozpoznawania komórek macierzystych pluripotentnych, komórek wysokoprodukcyjnych czy komórek immunologicznych. Ponadto, AI precyzyjnie określa pozycję i skupiska komórek. W metodzie MIR LIFT komórki są transferowane jedna po drugiej z częstotliwością do 100 Hz na mikroplaty. »W zależności od typu komórki, nawet do 100 procent z nich przeżyje ten proces«, wyjaśnia dr Nadine Nottrodt, kierowniczka grupy biofabrykacji, która nadzoruje wspólny projekt rozwojowy Fraunhofer ILT wraz z kierownikiem projektu Richardem Lensingiem.

Sam proces LIFT jest niezwykle prosty. Krótki impuls laserowy trwający dziewięć nanosekundów i o energii kilku mikrojouli wystarcza, by podgrzać ciecz pod wybraną komórką i wywołać powstanie parowej bańki. Komórka, wcześniej enzymatycznie rozłączona z otaczającym ją zespołem, jest przez bańkę lekko podniesiona. Gdy bańka zapada się, powstaje podciśnienie, które zasysa komórkę do kultury na mikroplacie. »Próbki zawierają komórki rozrzucone losowo. Dlatego nasz system skanuje ustalone siatki i transferuje komórki, które znajdują się w promieniu 50 mikrometrów od punktu skupienia«, wyjaśnia Lensing. W tym miejscu LIFTOSCOPE może precyzyjnie sterować i transferować komórki w wysokiej rozdzielczości, optycznie nadzorując cały proces laserowy. W razie potrzeby można połączyć proces LIFT z markerami fluorescencyjnymi, aby identyfikować konkretne komórki. Jednak bez dodatków, metoda ta działa niezawodnie. Wynika to z dwóch powodów: po pierwsze, precyzyjna lokalizacja za pomocą AI zapewnia, że komórki są faktycznie wykrywane przez strumień i trafiają na mikroplaty. Po drugie, Fraunhofer ILT udało się wyeliminować z procesu początkowo potrzebne metaliczne absorbery, dzięki ciągłemu rozwojowi metody LIFT. Zastosowanie lasera podczerwonego o długości fali 2940 nanometrów bezpośrednio podgrzewa wodę w systemie, podczas gdy polimery na probówkach nie absorbują tej długości fali lub robią to w minimalnym stopniu.

Stały ruch kontra proces zatrzymany i ruszający

Celem zespołu jest utrwalenie w pełni zautomatyzowanego rozpoznawania komórek i procesu LIFT w celu zapewnienia wysokiej wydajności oraz ograniczenia czasu całego procesu do dziesięciu minut na pełną mikroplatę. Wymaga to bardzo precyzyjnej aktywacji zarówno do obrazowania, jak i do ustawiania fokusu lasera w takt procesu. Zapewnia to rozdzielczość obrazu niezbędną do AI do rozpoznawania i pomiaru komórek oraz dokładne pozycjonowanie fokusu lasera z dokładnością do 25 mikrometrów pod komórką. Transfer pojedynczej komórki trwa zaledwie 200 mikrosekund. Z LIFTOSCOPE można obsłużyć i przenieść na mikroplaty nawet 10 000 komórek w ciągu 100 sekund.

Fraunhofer opracował dwie różne strategie poruszania kulturą komórkową. »W trybie zatrzymany i ruszający się, przed i po transferze komórki należy zrobić krótką przerwę, ponieważ każde zatrzymanie wywołuje hydrodynamiczne turbulencje w próbce, które muszą się uspokoić przed kolejnym transferem«, relacjonuje Nottrodt. Ta strategia pozwala na sortowanie próbek z wieloma różnymi komórkami i zmniejsza nakład pracy przy przygotowaniu próbek, ale przerwy obniżają wydajność. W drugim, ciągłym trybie, LIFTOSCOPE przesuwa probówki w wyznaczonym siatką układzie do 1600 linii z odległością 50 mikrometrów i transferuje każdą komórkę, która znajdzie się w polu widzenia. Oszczędność czasu tej metody rośnie wraz z liczbą transferowanych komórek. Już przy 10 000 komórek transferowanych, proces ciągły jest ponad dwukrotnie szybszy, a przy 100 000 komórek jest już 20-krotnie szybszy niż tryb zatrzymany i ruszający.

Nowa technologia oparta na AI i laserze wyznacza drogę do w pełni zautomatyzowanej, wysoce wydajnej izolacji żywych komórek. Według Nottrodt, dotychczasowy przebieg projektu pokazuje, że synchronizacja procesu LIFT z częstotliwością klatek kamery wysokiej prędkości — a tym samym sortowanie pojedynczych komórek z szybkością 100 na sekundę — jest możliwa. Kolejnym krokiem jest rozwinięcie prototypu do wersji komercyjnej. »Zainteresowani mogą odwiedzić wspólny stoisko Fraunhofer-Gesellschaft w hali A3/407 na analytica 2024, aby dokładniej zapoznać się z LIFTOSCOPE«, zapraszają Nottrodt i Lensing. W świetle potencjału medycyny spersonalizowanej, pożądane jest, aby ta technologia szybko trafiła do praktyki medycznej, farmaceutycznej i klinicznej.