Selezione automatizzata ad alto rendimento di cellule viventi con laser e intelligenza artificiale

Sferoide di fibroblasti 3T3 colorati con actina per il trasferimento LIFT, coltivati in microvasche realizzate con laser. © Fraunhofer ILT, Aachen / Sferoide di fibroblasti 3T3 colorati con actina per il trasferimento LIFT, coltivati in microvasche realizzate con laser. © Fraunhofer ILT, Aachen, Germania

Il LIFTOSCOPE combina microscopia ad alta velocità, analisi basata sull'intelligenza artificiale e localizzazione di cellule viventi e gruppi di cellule con il trasferimento in avanti indotto dal laser (LIFT). Il raggio laser viene accoppiato direttamente nel percorso del raggio dello microscopio tramite specchi. Gli utenti possono passare dalla visualizzazione tramite fotocamera al processo LIFT. © Fraunhofer ILT, Aachen, Germania

Il metodo MIR LIFT trasferisce cellule vive a un'alta velocità fino a 100 Hz, una dopo l'altra, su piastre microtitolari (MTP). Per poter integrare il processo altamente efficiente nelle piattaforme di microscopia indipendentemente dal produttore, il Fraunhofer ILT ha sviluppato, tra le altre cose, il supporto mostrato qui per una MTP a sei pozzetti. © Fraunhofer ILT, Aachen

Ricercatori del Fraunhofer ILT stanno testando il LIFTOSCOPE per la selezione automatizzata ad alta capacità di cellule viventi assistita dall'IA mediante radiazioni laser pulsate. © Fraunhofer ILT, Aachen

I test su colture cellulari viventi stanno diventando sempre più importanti per la medicina personalizzata, lo sviluppo di farmaci e la ricerca clinica. Un nuovo metodo ad alta produttività supportato dall'IA dei Fraunhofer Institute di Aquisgrana per la Tecnologia Laser ILT e per la Tecnologia della Produzione IPT permette di isolare automaticamente tipi cellulari specifici. Con il cosiddetto LIFTOSCOPE, i laboratori possono localizzare, identificare e misurare le dimensioni e i punti di interesse di decine di cellule viventi al secondo, per poi trasferirle tramite Laser-Induced Forward Transfer (LIFT) in piastre microtitolate.

Le cellule staminali pluripotenti sono la chiave per la medicina personalizzata. Se si riesce a isolare queste cellule da campioni di sangue e tessuti, è possibile riprodurre tipi cellulari di diversi tessuti. Queste colture cellulari consentono di effettuare test personalizzati di farmaci e tolleranza al di fuori del corpo e rappresentano uno strumento prezioso nello sviluppo di terapie altamente specifiche e personalizzate. Tuttavia, per integrare il trattamento personalizzato nella routine clinica, sono necessari metodi efficienti per isolare le cellule staminali pluripotenti. Inoltre, la ricerca farmaceutica è alla ricerca di metodi per separare le cosiddette cellule ad alta produttività per lo sviluppo di farmaci da culture policlonali e trasferirle in culture monoclonali, senza compromettere la vitalità o la capacità di divisione delle cellule. Anche le cliniche hanno dovuto riconoscere durante la pandemia che i metodi disponibili per l'isolamento e l'analisi di cellule (immuno) da campioni di pazienti stanno raggiungendo i limiti di capacità dei laboratori.

I Fraunhofer Institute di Aquisgrana per la Tecnologia Laser ILT e per la Tecnologia della Produzione IPT presenteranno alla fiera mondiale per la tecnologia di laboratorio, analisi e biotecnologia, analitica ’24, (9-12 aprile 2024), un dispositivo che, grazie alla classificazione e isolamento cellulare completamente automatizzati, garantisce un aumento significativo dell’efficienza. Il LIFTOSCOPE integra un processo ad alta produttività supportato dall’IA in un microscopio inverso di mercato, dotato di una telecamera ad alta velocità e di una sorgente di flash. Per identificare le cellule in microsecondi e trasferirle con tassi di sopravvivenza superiori al 90% in piastre microtitolate, il LIFTOSCOPE combina tre processi high-tech in un unico dispositivo.

Con IA e laser verso una selezione cellulare completamente automatizzata

Il team di progetto ha integrato direttamente nel percorso ottico del microscopio il processo MIR LIFT, sviluppato e brevettato dal Fraunhofer ILT. Un sistema di telecamere collegato fornisce cento immagini ad alta risoluzione al secondo. In questi dati visivi, l’IA sviluppata dal Fraunhofer IPT identifica i tipi cellulari desiderati basandosi sulla segmentazione semantica. L’IA può essere addestrata a riconoscere cellule staminali pluripotenti, cellule ad alta produttività o cellule immunitarie. Inoltre, l’IA determina la posizione esatta e i punti di interesse delle cellule. Nel metodo MIR LIFT, le cellule vengono trasferite una alla volta su una piastra microtitolata a una frequenza fino a 100 Hertz. »A seconda del tipo cellulare, fino al 100% delle cellule sopravvive a questa procedura«, spiega la Dott.ssa Nadine Nottrodt, responsabile del gruppo di biofabbricazione, che ha seguito il progetto di sviluppo congiunto del Fraunhofer ILT insieme al project manager Richard Lensing.

Il metodo LIFT stesso è sorprendentemente semplice. Un impulso laser di nove nanosecondi con energia di pochi microjoule è sufficiente per stimolare il mezzo liquido immediatamente sotto la cellula bersaglio a formare una bolla di vapore. La cellula, precedentemente sciolta enzymaticamente dal suo insieme, viene leggermente sollevata dalla bolla. Quando la bolla collassa, si crea una depressione che risucchia la cellula nel contenitore della cultura della piastra microtitolata. »Le cellule sono distribuite casualmente nei campioni. Per questo, il nostro sistema percorre una griglia predefinita e trasferisce le cellule che si trovano entro un raggio di 50 micrometri dal punto focale«, spiega Lensing. In questa zona, il LIFTOSCOPE può dirigere con precisione ottica e laser altamente preciso le cellule, trasferendole con esattezza. Se necessario, il processo di LIFT può essere combinato con marcatori fluorescenti per identificare cellule specifiche. Tuttavia, il metodo funziona in modo affidabile anche senza additivi. Ciò è possibile per due motivi: da un lato, la localizzazione precisa tramite IA garantisce che le cellule siano effettivamente catturate dal getto e trasferite nelle piastre. Dall’altro, il Fraunhofer ILT è riuscito, grazie a un continuo sviluppo del metodo LIFT, a eliminare gli assorbitori metallici inizialmente necessari nel processo. Utilizzando un laser a infrarossi medi con lunghezza d’onda di 2940 nanometri, si stimola direttamente l’acqua presente nel sistema, mentre i polimeri dei supporti di prova assorbono poco o nulla questa lunghezza d’onda.

Movimento continuo versus processo stop-and-go

L’obiettivo del team di progetto è di stabilizzare la rilevazione completamente automatizzata delle cellule e il processo LIFT in modo da garantire alte velocità di produzione e limitare il tempo totale per una piastra microtitolata a dieci minuti. Ciò richiede una strumentazione di altissima precisione sia per l’imaging che per il posizionamento del fuoco laser nel ciclo di processo. Con questa, si garantisce da un lato la risoluzione dell’immagine necessaria per il riconoscimento e la misurazione delle cellule tramite IA, e dall’altro la posizione del fuoco laser con precisione di 25 micrometri sotto la cellula. Il trasferimento di una singola cellula si completa in 200 microsecondi. Con il LIFTOSCOPE, si possono indirizzare e trasferire 10.000 cellule in 100 secondi.

Il team di Fraunhofer ha adottato due strategie diverse per il movimento delle colture cellulari. »Nel funzionamento stop-and-go, è necessario inserire una breve fase di pausa prima e dopo il LIFT delle cellule, perché ogni fermata provoca flussi idrodinamici nel campione che devono calmarsi prima del trasferimento successivo«, riferisce Nottrodt. Sebbene questa strategia consenta di ordinare campioni con molte cellule diverse e riduca il lavoro di preparazione, le pause riducono l’efficienza complessiva. Nel processo continuo, il secondo approccio, il LIFTOSCOPE muove i supporti di prova lungo una griglia definita di fino a 1600 linee con una distanza di 50 micrometri, trasferendo in movimento continuo ogni cellula che entra nel punto focale. Il vantaggio temporale di questo metodo aumenta con il numero di cellule trasferite. Già con 10.000 cellule trasferite, il processo continuo è più che doppio più veloce rispetto al metodo stop-and-go, e con 100.000 cellule è già 20 volte più rapido.

Il nuovo metodo basato su IA e laser rappresenta la strada verso un’isolamento completamente automatizzato e altamente efficiente di cellule viventi. Secondo Nottrodt, l’attuale andamento del progetto dimostra che è possibile sincronizzare il LIFT delle cellule con la frequenza di acquisizione della telecamera ad alta velocità, raggiungendo un’ordinazione di 100 cellule al secondo. Il passo successivo è sviluppare questa tecnologia prototipale fino alla maturità commerciale. »Gli interessati possono visitare lo stand congiunto della Fraunhofer-Gesellschaft nella Hall A3/407 di analitica 2024 per avere un’idea più precisa del LIFTOSCOPE«, invitano Nottrodt e Lensing. Con uno sguardo al potenziale della medicina personalizzata, sarebbe auspicabile che questa tecnologia trovi rapidamente applicazione nella pratica medica, farmaceutica e clinica.