Surveillance continue des germes aéroportés dans des environnements critiques

Image 1 : Formule

Tableau 2

Image 2 : Formule

Figure 1 : Modèle de flux d'air d'un collecteur d'air actif

Figure 2 : Géométrie du collecteur d'air actif

Tableau 3

Gilberto Dalmaso, PhD.

Anna Campanella, PhD.

Paola Lazzeri

Résumé

Depuis plus de 10 ans, les directives cGMP mettent en évidence les attentes concernant la surveillance microbiologique continue de l'air du processus dans les zones de classe A (ISO 5) et B (ISO 7), en faisant référence à la méthode des plaques de sédimentation. Cependant, comme cette méthode repose sur le dépôt gravitationnel de particules sur une surface, elle est considérée comme une méthode non validable.

Introduction

Les salles blanches sont des zones contrôlées où le degré de contamination doit correspondre à un niveau de pureté défini. Dans les salles blanches définies par GMP, la contamination microbiologique est un paramètre critique à contrôler. La sécurité de la stérilité pour les produits étiquetés comme stériles peut être assurée par une stérilisation terminale du produit final. Parmi ces produits, une grande partie concerne des médicaments stériles, qui toutefois sont instables dans les procédés de stérilisation classiques et nécessitent donc une fabrication aseptique. Les autorités reconnaissent que la fabrication aseptique du produit final comporte un risque de contamination supérieur à celui du processus de stérilisation finale.

Pour réduire ce risque, les autorités ont fortement conseillé aux entreprises pharmaceutiques de mettre en place une solution permettant de séparer les produits stériles du personnel. Cela a conduit à la mise en œuvre de systèmes de barrière, largement répandus aujourd'hui dans la fabrication pharmaceutique stérile.

Avec les nouvelles technologies, il est possible de surveiller de manière continue et fiable le degré de contamination microbiologique dans la salle blanche. Cependant, les directives GMP en vigueur pour la définition des limites de contamination microbienne font toujours référence à la méthode des plaques de sédimentation avec un prélèvement toutes les 4 heures, et les solutions microbiologiques traditionnelles basées sur la croissance restent l’approche la plus courante pour la surveillance de l’air. Les fabricants pharmaceutiques utilisent principalement des plaques de sédimentation pour la détection continue de la contamination microbienne, même si la collecte « continue » d’un mètre cube d’air, la variante la plus courante, ne dure souvent pas plus de 40 minutes. De plus, les limitations naturelles des milieux de croissance permettent souvent de surveiller uniquement de courtes périodes microbiennes.

Distribution de la taille des particules d’air et efficacité des plaques de sédimentation

Les particules transportées par l’air, organiques ou inorganiques, varient en taille, forme et densité. Sans référence standard pour les particules en suspension dans l’air, on utilise des approximations générales telles que le diamètre équivalent géométrique pour obtenir des valeurs concernant la taille, la forme et la densité d’une particule.
Le diamètre équivalent correspond dans ce cas au diamètre d’une sphère ayant la même propriété géométrique, qui se dépose dans l’air à la même vitesse que la particule considérée. Sur la base de cette estimation, l’efficacité des méthodes de surveillance microbiologique, c’est-à-dire la récupération des micro-organismes, est déterminée. Par exemple, il y a quelques années, le rendement de la plaque de sédimentation était estimé à partir de paramètres standardisés pour des conditions statiques de l’air ambiant. Ces paramètres offrent une représentation insuffisante des environnements critiques des salles blanches pharmaceutiques, où des conditions dynamiques prévalent (par exemple, plusieurs renouvellements d’air par heure selon la classification).

Calcul de la vitesse de dépôt des particules d’air

Une particule sphérique, non chargée, sans sédiments de turbidité, se déplaçant à une vitesse constante selon la formule suivante (1) : voir Image 1.

Où Vc représente la vitesse de contamination (c’est-à-dire la vitesse de dépôt d’un KbE), r le rayon de la particule, g l’accélération due à la gravité, p la densité de la particule, pa la densité de l’air et ɳ la viscosité de l’air.

Entre 2015 et 2016, Whyte et al. ont publié une série d’articles traitant de la déposition des particules en suspension dans l’air sur des surfaces critiques dans les salles blanches [1-4]. Les mécanismes importants de dépôt identifiés étaient la gravitation, la turbulence, l’attraction électrostatique et, pour les particules inférieures à 0,5 µm, le mouvement brownien. Les petites particules sont plus susceptibles d’être transportées hors de la salle blanche et ont peu de temps pour se déposer, tandis que les plus grosses continuent de se déposer sous l’effet de la gravité. Une augmentation de l’intensité de la turbulence de l’air peut contribuer à ce processus. Pour une gamme de tailles de particules comprise entre 5 et 30 µm et appliquée à une zone ISO classe 5, on estime une augmentation du taux de dépôt par un facteur de cinq. Pour des particules de 0,3 ou 0,5 µm, une influence moindre de la gravité est attendue.

Il a été constaté que la vitesse de dépôt augmente avec la propreté croissante de la salle blanche [4]. Les résultats de l’étude sont présentés dans le tableau 2.

Efficacité des collecteurs de micro-organismes en air actifs

Dans l’annexe B de l’ISO 14698:2003, une méthode pour déterminer l’efficacité de collecte des collecteurs de micro-organismes en air est décrite selon deux aspects : l’efficacité physique et l’efficacité biologique.

- L’efficacité physique est la capacité à capturer différentes tailles de particules lors du prélèvement.

- L’efficacité biologique est l’efficacité du prélèvement pour la récupération des particules porteuses de micro-organismes (MCP).

L’efficacité physique est identique pour les particules non microbiennes, les particules porteuses de micro-organismes et les micro-organismes transportés par l’air. L’efficacité biologique est considérée comme inférieure à l’efficacité physique, car elle dépend de la survie des micro-organismes recueillis ainsi que du milieu de collecte, sur lequel ils peuvent croître. La méthode de test décrite dans l’annexe B concerne principalement l’efficacité physique.

La méthode expérimentale pour déterminer l’efficacité physique consiste à générer un aérosol de test dans une chambre d’essai (à humidité relative et température définies). Cet aérosol peut être produit à partir d’une suspension de spores de Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073), de billes de polystyrène ou d’autres types de particules inorganiques. Bien que des résultats similaires soient obtenus, il faut considérer que certains collecteurs ne détectent pas toutes les particules inorganiques. En revanche, avec des micro-organismes, ceux-ci croissent en colonies visibles et identifiables.

Pour déterminer l’efficacité biologique, on peut utiliser Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990), qui permet de représenter une souche humaine de contamination. En raison des variations de l’efficacité de collecte, dues à la pulvérisation des solutions et aux conditions de collecte, cette méthode est considérée comme moins fiable que celle de l’efficacité physique.

Chaque test doit être réalisé parallèlement avec un système de référence (filtre à membrane et collecteur de micro-organismes en air) pour obtenir l’efficacité du prélèvement (5) : voir Image 2.

Dans l’ISO 14698:2003, l’annexe A indique que le choix du collecteur de micro-organismes en air à utiliser dans une zone à risque dépend de l’objectif du prélèvement. De plus, l’appareil doit présenter une vitesse d’impact (vitesse de l’air frappant le milieu de culture) qui constitue un compromis entre :

1. une vitesse suffisamment élevée pour capturer des particules organiques jusqu’à environ 1 µm, et
2. une vitesse pas trop élevée pour préserver la viabilité des particules, en évitant les dommages mécaniques ou la rupture de amas bactériens ou de mycètes.

Dans le secteur des sciences de la vie, la recommandation de la norme ISO est généralement d’utiliser un collecteur de micro-organismes avec un rendement physique d’environ 50 % ou plus pour une taille de particule d’environ 1 µm (valeur d50 de 1 µm). Les collecteurs avec une valeur d50 d’environ 1 µm sont largement reconnus. Sachant que les particules porteuses de micro-organismes dans les aérosols ont une taille comprise entre 10 et 20 µm, pourquoi une bonne performance jusqu’à 1 µm est-elle alors importante ? Parce que les petites particules sont plus difficiles à capturer que les macro-particules plus grosses (particules > 5 µm), et que 1 à 3 µm correspond à la taille des bactéries individuelles les plus courantes.

Comment les particules sont-elles capturées par les collecteurs de micro-organismes actifs ?

Lorsque un flux gazeux traverse un changement de direction brusque, les particules transportées ont tendance, en raison de leur rapport masse/longueur, à continuer dans leur direction initiale. Les particules de tailles et de densités différentes suivent des trajectoires différentes et peuvent être collectées séparément. Lorsqu’un jet d’air est accéléré dans une buse, les particules qu’il transporte sont propulsées à la même vitesse que le milieu environnant (l’air) et suivent la ligne de flux. Si les lignes de flux changent rapidement à la sortie de la buse, les trajectoires des particules se séparent nettement des lignes de flux en fonction de leur inertie. Autrement dit, les particules suivent une ligne droite, et lorsqu’elles rencontrent une surface sur leur chemin, elles peuvent y adhérer et ainsi être capturées.

Les collecteurs de micro-organismes en air actifs (impactors) sont conçus pour capter les particules en collisionnant celles-ci avec une surface solide. La géométrie de l’impacteur (W, T, S) est conçue pour que le flux laminaire pénètre dans la buse (Re < 2300), que la vitesse soit aussi élevée que possible et que la valeur d50 soit aussi basse que possible.

Plaques de sédimentation et alternatives

Les plaques de sédimentation donnent des indications sur les particules porteuses de micro-organismes, dont le diamètre moyen peut dépasser 10 µm. Selon la définition de l’annexe C de l’ISO 14698-1:2003, une plaque de sédimentation, en tant que collecteur passif de micro-organismes en air, ne mesure pas le nombre total de particules organiques dans l’air, mais plutôt la vitesse à laquelle ces particules se déposent sur des surfaces.

Les plaques de sédimentation sont recommandées pour la surveillance continue de l’air dans les zones critiques, car elles nécessitent une manipulation limitée par rapport aux collecteurs actifs. Pour simplifier et réduire la manipulation tout en diminuant le risque de contamination pour l’opérateur, les impacteurs jetables constituent une alternative idéale. Si le fabricant respecte les exigences ISO et les bonnes pratiques en laboratoire, ils peuvent également constituer une solution fiable pour la collecte à long terme.

Comparaison entre plaques de sédimentation et collecte active continue

En raison de leur faible sensibilité et de l’importance discutable des données obtenues, les plaques de sédimentation ne sont pas recommandées pour les zones de classe A. Elles ne sont autorisées que dans les zones de classes B, C et D, où le mouvement de l’air (turbulence) favorise un dépôt plus important de particules porteuses de micro-organismes.

Dans le cas de l’utilisation d’équipements modernes de salles blanches pour le personnel en zones aseptiques, on attend des particules porteuses de micro-organismes une taille comprise entre 0,5 et 5 µm. La collecte active continue remplace l’utilisation des plaques de sédimentation et la collecte active intermittente ou individuelle pour les zones de classe A. La comparaison des méthodes est présentée dans le tableau 3.

Motifs de surveillance des différents niveaux de pureté

La qualification des salles blanches pharmaceutiques est essentielle pour la fabrication de médicaments où la sécurité du patient joue un rôle crucial. La qualification microbiologique permet de déterminer si l’air est propre pendant la fabrication. Après qualification et résultat positif, les entreprises pharmaceutiques doivent élaborer un plan de surveillance dans le cadre de leur stratégie de contrôle de la contamination, qui documente et démontre la qualité de l’air pendant la production de lots conformément aux spécifications établies lors de la validation.

Le risque de contamination dans la surveillance des zones de classe A (ISO 5 – zones critiques) et B (ISO 7) en fabrication aseptique est analysé en tenant compte des points suivants :

- Les zones de classe A concernent le produit, les matériaux en contact avec le produit et les surfaces de contact avec l’environnement. Les zones particulièrement critiques sont surveillées en continu à toutes les étapes de la production avec une fréquence élevée.
- La zone de classe B sert à protéger les environnements de classe A et nécessite la présence du personnel. Dans ce cas, la surveillance microbiologique a une importance différente quant à la fréquence et aux limites de mesure. L’objectif de la surveillance dans ces zones est de contrôler la contamination microbiologique conformément aux spécifications et aux résultats de qualification. La tendance microbienne dans ces zones doit rester constante ou légèrement décroissante, en cas de flore microbienne prévisible et connue.

Une surveillance microbiologique continue de l’air dans la zone de classe A est déjà exigée par les directives cGMP et mise en œuvre pour la surveillance globale des particules. Elle fournit des informations importantes sur la quantité et la taille des particules totales présentes à un point de prélèvement donné dans l’air. Les particules totales comprennent :

- Particules inertes
- Particules porteuses de micro-organismes (sans leur nombre connu)
- Micro-organismes eux-mêmes en tant que particules, détectables par le compteur de particules

La sécurité de la qualité doit prévoir une stratégie pour les deux domaines avec des méthodes validées (selon la pharmacopée ou les normes internationales) afin de soutenir les analyses et de permettre la recherche d’une éventuelle corrélation entre événements.

Conclusions

Dans les zones ISO 5 / classe A où le flux d’air est défini et le risque de contamination élevé, l’utilisation d’une plaque de sédimentation, en raison de sa faible sensibilité, constitue une stratégie de surveillance insuffisante. Les plaques de sédimentation ont une importance accrue dans les environnements statiques avec peu de variations de l’air, où le dépôt de particules et de micro-organismes est plus probable.

Une surveillance microbiologique continue de l’air dans les zones critiques doit être réalisée avec des méthodes validées telles que les collecteurs de micro-organismes en air actifs. Cette stratégie répond aux exigences des autorités de contrôle en matière de meilleure connaissance des processus, de stratégie de contrôle de la contamination plus fiable et d’une sécurité accrue de la stérilité du produit final.

Auteurs

Gilberto Dalmaso, PhD
Responsable mondial des sciences de la vie,
Gilberto Dalmaso possède plus de 25 ans d’expérience en microbiologie pharmaceutique et en assurance de la stérilité, principalement chez GlaxoSmithKline (GSK). En 2003, son laboratoire a reçu de l’autorité sanitaire américaine FDA la première approbation mondiale dans le cadre de l’initiative PAT pour les méthodes microbiologiques rapides (RMM). Gilberto est aujourd’hui responsable scientifique pour les systèmes de mesure de particules dans le secteur des sciences de la vie ; il est membre du comité européen PDA, intervenant lors de nombreux symposiums sur la microbiologie et l’industrie pharmaceutique en Europe, Asie et États-Unis, ainsi qu’auditeur de systèmes qualité selon ISO 9001 et HACCP.

Anna Campanella, PhD.
Sécurité de la stérilité mondiale et conseil, systèmes de mesure de particules
Anna Campanella, PhD, est responsable de la sécurité de la stérilité mondiale et du conseil concernant les systèmes de mesure de particules. Dans cette fonction, elle utilise son expérience sectorielle pour collaborer avec les entreprises pharmaceutiques, élaborer et mettre en œuvre des stratégies scientifiques, des principes de surveillance, de contrôle et d’amélioration de l’état chimique, physique et microbiologique de divers processus de production. Elle possède une expérience variée dans le domaine pharmaceutique, notamment un doctorat en médecine moléculaire, une expertise en QA/QC, validation de méthodes chimiques et microbiologiques, validation de processus de fabrication stériles, ainsi qu’une expérience dans les aspects microbiologiques des procédés de fabrication aseptiques.

Paola Lazzeri
Spécialiste GMP au sein de l’équipe de sécurité de la stérilité, secteur sciences de la vie
Paola Lazzeri possède une expérience dans le soutien aux entreprises pharmaceutiques pour le contrôle de la contamination, y compris les stratégies de nettoyage et de désinfection. Son expérience avec les fabricants pharmaceutiques a débuté en 2005 dans une société de distribution de systèmes de contrôle de contamination en salle blanche.
Aujourd’hui, Paola est spécialiste GMP dans l’équipe de sécurité de la stérilité concernant les systèmes de mesure de particules. Dans ce rôle, elle collabore avec des entreprises pharmaceutiques pour conseiller sur le développement et la mise en œuvre de principes de surveillance et de contrôle de la contamination microbiologique, en améliorant les stratégies de nettoyage et de désinfection scientifiques.

Références

[1] W. Whyte, K. Agricola et M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, UK ; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, Pays-Bas ; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, Pays-Bas) 'Dépôt de particules en suspension dans l’air dans les salles propres : calcul de la contamination du produit et de la classe de salle blanche requise' - Revue de l’air pur et de la confinement, n° 26, avril 2016.

[2] W. Whyte, K. Agricola et M. Derks 'Dépôt de particules en suspension dans l’air dans les salles propres : mécanismes de dépôt' - Revue de l’air pur et de la confinement – (2015) n° 24, p. 4-9.

[3] W. Whyte, K. Agricola et M. Derks 'Dépôt de particules en suspension dans l’air dans les salles propres : relation entre le taux de dépôt et la concentration en suspension' - Revue de l’air pur et de la confinement - (2016) n° 25, p. 4-10.

[4] W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) et T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) 'Vélocités de dépôt des particules microbiennes en suspension dans l’air' - European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016 ; 21(2) : 45-49.

Termes et définitions

Collecteur de micro-organismes en air actif (Impacteur) : appareil destiné à capturer des particules en suspension dans l’air ou autres gaz par collision avec une surface solide.

Surveillance active de l’air : surveillance de l’air ambiant à l’aide d’un collecteur de micro-organismes actif (impacteur).

Surveillance passive de l’air : surveillance de l’air ambiant à l’aide de plaques de sédimentation. Les particules suivent le flux d’air ambiant et tombent sur les plaques d’agar.

Particules organiques : particules constituées d’un ou plusieurs micro-organismes vivants ou qui les soutiennent. [21]