Monitoraggio continuo della qualità dell'aria in ambienti critici

Immagine 1: Formula

Tabella 2

Immagine 2: Formula

Figura 1: Modello di flusso d'aria di un campionatore di aria attivo

Figura 2: Geometria del campionatore di aria attivo

Tabella 3

Gilberto Dalmaso, PhD.

Anna Campanella, Dott.ssa

Paola Lazzeri

Sommario

Da oltre 10 anni nelle linee guida cGMP vengono evidenziate le aspettative riguardo al monitoraggio microbiologico continuo dell'aria di processo in ambienti di Classe A (ISO 5) e Classe B (ISO 7), facendo riferimento al metodo delle piastre di sedimentazione. Tuttavia, poiché si basano sull'impatto di particelle sulla superficie dovuto alla gravità, le piastre di sedimentazione sono considerate metodi non validabili.

Introduzione

Le camere bianche sono ambienti controllati in cui il livello di contaminazione deve corrispondere a un grado di purezza definito. Nei ambienti di qualità GMP, la contaminazione microbiologica è un parametro critico da controllare. La sicurezza della sterilità per i prodotti etichettati come sterili può essere raggiunta tramite una sterilizzazione finale del prodotto finito. Tra questi prodotti ci sono, tra l'altro, una grande parte di farmaci sterili, che tuttavia sono instabili nei processi di sterilizzazione convenzionali e richiedono una lavorazione asettica. Le autorità riconoscono che la produzione asettica del prodotto finale comporta un rischio di contaminazione superiore rispetto al processo di sterilizzazione finale.

Per ridurre questo rischio, le autorità hanno raccomandato con urgenza alle aziende farmaceutiche di implementare soluzioni che prevedano la separazione del personale dai prodotti sterili. Ciò ha portato all'adozione di sistemi di barriera, come quelli oggi ampiamente diffusi nelle produzioni farmaceutiche sterili.

Con le nuove tecnologie, è possibile monitorare in modo continuo e affidabile il livello di contaminazione microbiologica nell'ambiente di sala bianca. Tuttavia, le linee guida GMP comuni per la definizione dei limiti di contaminazione microbiologica continuano a fare riferimento alle piastre di sedimentazione con campionamento di 4 ore e le soluzioni microbiologiche tradizionali basate sulla crescita rimangono l'approccio più diffuso per il monitoraggio dell'aria. I produttori farmaceutici utilizzano principalmente le piastre di sedimentazione per il rilevamento continuo della contaminazione microbiologica, anche se la raccolta "continua" di un metro cubo di aria, la variante più comune, spesso dura meno di 40 minuti. Inoltre, le limitazioni naturali dei mezzi di crescita consentono solo brevi monitoraggi microbiologici.

Distribuzione delle dimensioni delle particelle d'aria e efficacia delle piastre di sedimentazione

Le particelle trasportate dall'aria, organiche e non organiche, variano in dimensione, forma e densità. Senza un riferimento standard per le particelle trasportate dall'aria, si utilizzano approssimazioni generali come il diametro equivalente geometrico per ottenere valori di dimensione, forma e densità di una particella.
Il diametro equivalente corrisponde in questo caso al diametro di una sfera con le stesse caratteristiche geometriche, che si deposita nell'aria alla stessa velocità della particella considerata. Con questa stima si determina l'efficacia dei metodi di monitoraggio microbiologico, cioè il recupero di microrganismi. Ad esempio, alcuni anni fa si stimava il rendimento della piastra di sedimentazione sulla base di parametri standardizzati per condizioni ambientali statiche. Questi parametri forniscono una rappresentazione insufficiente di ambienti critici di sale bianca, in cui prevalgono condizioni dinamiche (ad esempio, più ricambi d'aria all'ora a seconda della classificazione).

Calcolo della velocità di sedimentazione delle particelle d'aria

Una particella sferica, non caricata, senza sedimenti opachi, che si muove a velocità costante secondo la seguente formula (1): vedi Immagine 1.

Dove Vc rappresenta la velocità di contaminazione (cioè la velocità di sedimentazione di un'unità formante colonie, UFC), r il raggio della particella, g l'accelerazione dovuta alla gravità, p la densità della particella, pa la densità dell'aria e ɳ la viscosità dell'aria.

Tra il 2015 e il 2016, Whyte et al. pubblicarono una serie di articoli che trattavano l'accumulo di particelle trasportate dall'aria su superfici critiche in sale bianche [1-4]. I meccanismi principali di deposizione sono stati identificati come sedimentazione gravitazionale, deposizione turbolenta, attrazione elettrostatica e, per particelle inferiori a 0,5 µm, il moto browniano. Particelle più piccole vengono trasportate con maggiore probabilità all'esterno della sala bianca e hanno meno tempo per depositarsi, mentre le particelle più grandi continuano a depositarsi per effetto della gravità. Un aumento dell'intensità della turbolenza dell'aria può contribuire. Per particelle tra 5 e 30 µm e applicato a una Classe ISO 5, si stimò un aumento della velocità di deposizione di cinque volte. Per particelle di 0,3 o 0,5 µm si prevedeva un minore effetto della gravità.

È stato riscontrato che la velocità di deposizione aumenta con il livello di purezza della sala bianca [4]. I risultati dello studio sono riportati nella Tabella 2.

Efficienza dei campionatori attivi di microbi dell'aria

In ISO 14698:2003 Allegato B viene considerato un metodo per determinare l'efficienza di raccolta dei campionatori di microbi dell'aria riguardo a due aspetti: l'efficienza fisica e l'efficienza biologica.

- L'efficienza fisica è la capacità di catturare diverse dimensioni di particelle durante il campionamento.

- L'efficienza biologica è l'efficienza nel recupero di particelle portatrici di microrganismi (MCP).

L'efficienza fisica è uguale per particelle non microbiologiche, particelle portatrici di microrganismi e microbi trasportati dall'aria. L'efficienza biologica si presume inferiore a quella fisica, poiché dipende dalla sopravvivenza dei microrganismi raccolti e dal supporto di raccolta su cui poi crescono. Il metodo di prova descritto nell'Allegato B si concentra principalmente sull'efficienza fisica.

Il metodo sperimentale per determinare l'efficienza fisica prevede la generazione di un aerosol di prova in una camera di prova (a umidità relativa e temperatura definite). L'aerosol di prova può essere generato con sospensioni di spore di Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073), con sfere di polistirolo o altri tipi di particelle non organiche. Nonostante risultati simili, bisogna considerare che alcuni campionatori potrebbero non riconoscere tutte le particelle inorganiche. Per i microrganismi, invece, si formano colonie facilmente visibili e identificabili.

Per determinare l'efficienza biologica, si può usare Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990), che rappresenta un ceppo di contaminazione umana. A causa delle variazioni nell'efficienza di raccolta, dovute all'iniezione delle soluzioni e alle condizioni di campionamento, questa metodologia è considerata meno affidabile rispetto a quella per l'efficienza fisica.

Ogni test deve essere eseguito in parallelo con un sistema di riferimento (filtro a membrana e campionatore di microbi dell'aria) per ottenere l'efficienza del campionatore (5): vedi Immagine 2.

In ISO 14698:2003 Allegato A, la scelta del campionatore di microbi dell'aria da utilizzare in zone a rischio dipende dallo scopo del campionamento. Inoltre, il dispositivo dovrebbe avere una velocità di impatto (velocità dell'aria che colpisce il supporto di coltura) che rappresenti un compromesso tra:

1. una velocità sufficientemente alta da catturare particelle organiche fino a circa 1 µm e
2. una velocità non troppo elevata da garantire la vitalità delle particelle, evitando danni meccanici o rotture di aggregati batterici o microbiomi.

Nel settore delle scienze della vita, la raccomandazione dello standard ISO è generalmente di un campionatore di microbi con una resa fisica di circa il 50% o quasi a una dimensione di particella di circa 1 µm (valore d50 di 1 µm), e campionatori con un valore d50 di circa 1 µm sono ampiamente riconosciuti. Se si sa che le particelle portatrici di microrganismi negli aerosol hanno dimensioni tra 10 e 20 µm, perché è importante una buona performance fino a 1 µm? Le particelle piccole sono più difficili da catturare rispetto alle macro particelle più grandi di 5 µm, e 1-3 µm corrisponde alla dimensione dei batteri singoli più comuni.

Come vengono catturate le particelle dai campionatori attivi di microbi dell'aria?

Quando un flusso di gas attraversa una deviazione di direzione netta, le particelle trasportate tendono, con l'aumentare del rapporto tra la loro massa e le loro dimensioni lineari, a muoversi nella loro direzione originale. Particelle di diverse dimensioni e densità seguono traiettorie differenti e possono essere raccolte separatamente. Quando un getto d'aria viene accelerato attraverso un ugello, le particelle trasportate vengono spinte con la stessa velocità del mezzo circostante (aria) e seguono la linea di flusso. Se le linee di flusso cambiano rapidamente all'uscita dell'ugello, le traiettorie delle particelle si discostano significativamente dalle linee di flusso a causa della loro inerzia. In altri termini, le particelle seguono una linea retta e, quando incontrano una superficie lungo il loro percorso, possono aderirvi e quindi essere catturate.

I campionatori attivi di microbi dell'aria (impattori) sono progettati per catturare le particelle dall'aria facendole collidere con una superficie solida. La geometria dell'impattore (W, T, S) è studiata in modo che il flusso laminare entri nell'ugello (Re < 2300), con una velocità il più alta possibile e un valore d50 il più basso possibile.

Piastra di sedimentazione e alternativa

Le piastre di sedimentazione forniscono indicazioni sulle particelle portatrici di microrganismi, il cui diametro medio può essere superiore a 10 µm. In ISO 14698-1:2003 Allegato C, la definizione di piastra di sedimentazione afferma che i campionatori di microbi dell'aria passivi, come le piastre di sedimentazione, non misurano il numero totale di particelle organiche nell'aria, ma piuttosto la velocità con cui le particelle organiche si depositano sulle superfici.

Le piastre di sedimentazione sono raccomandate per il monitoraggio continuo dei microbi dell'aria in ambienti critici, poiché richiedono una gestione limitata rispetto ai campionatori attivi. Per semplificare e ridurre la gestione, minimizzando il rischio di contaminazione per l'operatore, le impattori monouso rappresentano un'alternativa ideale. Se il produttore rispetta i requisiti ISO e le migliori pratiche di laboratorio, possono rappresentare anche una soluzione affidabile per il campionamento a lungo termine.

Piastre di sedimentazione rispetto al monitoraggio attivo continuo dei microbi dell'aria

A causa della loro scarsa sensibilità e dell'incertezza circa l'importanza dei dati risultanti, le piastre di sedimentazione non sono raccomandate per ambienti di Classe A. Sono consentite solo in ambienti di Classe B, C e D, dove il movimento dell'aria (turbolenze) favorisce una deposizione più significativa di particelle portatrici di microrganismi.

Nei moderni ambienti di sala bianca per il personale, si prevedono particelle portatrici di microrganismi di dimensioni tra 0,5 e 5 µm. La raccolta attiva continua dei microbi dell'aria sostituisce l'uso delle piastre di sedimentazione e la raccolta attiva singola o intermittente per le aree di Classe A. In Tabella 3 è riportato il confronto tra le metodologie.

Motivi per monitorare diversi livelli di purezza

La qualificazione delle sale bianche farmaceutiche è fondamentale per la produzione di medicinali, dove la sicurezza del paziente riveste un ruolo cruciale. La qualificazione microbiologica determina se l'aria durante la produzione è pulita. Dopo la qualificazione e un risultato positivo, le aziende farmaceutiche devono sviluppare un piano di monitoraggio che documenti e dimostri la qualità dell'aria durante la produzione dei lotti, secondo le specifiche stabilite durante la validazione.

Nel processo di analisi del rischio per il monitoraggio delle aree di Classe A (ISO 5) e Classe B (ISO 7) in produzione asettica, si considerano i seguenti punti:

- Le aree di Classe A comprendono il prodotto, i materiali a contatto con il prodotto e le superfici di contatto con l'ambiente. Le aree particolarmente critiche vengono monitorate continuamente in tutte le fasi di produzione con frequenze elevate.
- L'area di Classe B serve a proteggere le aree di Classe A e richiede la presenza del personale. In questo caso, il monitoraggio microbiologico ha un'importanza diversa per la frequenza e i limiti di misurazione. Lo scopo del monitoraggio in queste aree è il controllo della contaminazione microbiologica in conformità alle specifiche e ai risultati di qualificazione. La tendenza microbiologica di queste aree deve essere sempre costante o leggermente decrescente, in presenza di una flora microbica prevedibile.

Il monitoraggio microbiologico continuo dell'aria di Classe A è già richiesto dalle linee guida cGMP ed è implementato nel monitoraggio totale delle particelle. Fornisce informazioni importanti sulla quantità e sulla dimensione totale delle particelle presenti in un punto di campionamento specifico. Le particelle totali includono:

- Particelle inerti
- Particelle con microrganismi sulle superfici (senza contare il numero noto)
- Microrganismi stessi, che sono particelle e possono essere rilevati dai conteggiatori di particelle

La gestione della qualità dovrebbe prevedere una strategia per entrambe le aree con metodi validati (secondo Farmacopea o standard internazionali), per supportare le indagini e consentire la determinazione di eventuali correlazioni tra eventi.

Conclusioni

In ambienti di Classe ISO 5 / Classe A, dove il flusso d'aria è definito e il rischio di contaminazione è elevato, l'uso di una piastra di sedimentazione, a causa della sua scarsa sensibilità, rappresenta una strategia di monitoraggio insufficiente. Le piastre di sedimentazione assumono maggiore importanza in ambienti statici con pochi cambi d'aria, dove è più probabile la deposizione di particelle e microrganismi.

Un monitoraggio microbiologico continuo dell'aria in ambienti critici dovrebbe essere realizzato con metodi validati, come ad esempio gli impattori attivi. Questa strategia soddisfa le richieste delle autorità di vigilanza per una migliore conoscenza del processo, una strategia di controllo della contaminazione più affidabile e una sicurezza di sterilità significativamente superiore per il prodotto approvato.

Autori

Gilberto Dalmaso, PhD
Global Life Science, Responsabile Scientifico
Gilberto Dalmaso vanta oltre 25 anni di esperienza in microbiologia farmaceutica e sicurezza della sterilità, principalmente presso GlaxoSmithKline (GSK). Nel 2003, il suo laboratorio ricevette dalla FDA americana il riconoscimento come primo nel mondo per l'approvazione nell'ambito dell'iniziativa PAT di metodi microbiologici rapidi (Rapid Microbial Methods, RMM). Attualmente, Gilberto è Responsabile Scientifico per i sistemi di misurazione delle particelle in Global Life Science; è membro del Comitato Europeo PDA, relatore in numerosi simposi sulla microbiologia e l'industria farmaceutica in Europa, Asia e USA, e auditor di sistemi di qualità secondo ISO 9001 e HACCP.

Anna Campanella, PhD.
Sicurezza della sterilità globale e consulenza, sistemi di misurazione delle particelle
Anna Campanella, PhD, è responsabile della sicurezza della sterilità globale e consulenza riguardo ai sistemi di misurazione delle particelle. In questa funzione, utilizza la sua esperienza nel settore per collaborare con aziende farmaceutiche, sviluppando e implementando strategie scientifiche, principi di monitoraggio, controllo e miglioramento dello stato chimico, fisico e microbiologico di vari processi produttivi. Possiede un'esperienza diversificata nel settore farmaceutico, tra cui un dottorato in medicina molecolare, conoscenze in QA&QC, validazione di metodi chimici e microbiologici, validazione di processi di produzione sterile e esperienza in aspetti microbiologici dei processi di produzione asettica.

Paola Lazzeri
Specialista GMP nel team di sicurezza della sterilità, settore Scienze della Vita
Paola Lazzeri ha esperienza nel supportare le aziende farmaceutiche nel controllo della contaminazione, inclusa la strategia di pulizia e disinfezione. La sua esperienza con i produttori farmaceutici iniziò nel 2005 presso un'azienda di distribuzione di sistemi di controllo della contaminazione in ambienti di sala bianca.
Attualmente, Paola è specialista GMP nel team di sicurezza della sterilità riguardo ai sistemi di misurazione delle particelle. In questa funzione, collabora con le aziende farmaceutiche e le consiglia nello sviluppo e nell'implementazione di principi di monitoraggio e controllo della contaminazione microbiologica, migliorando le strategie di pulizia e disinfezione scientifica.

Riferimenti bibliografici

[1] W. Whyte, K. Agricola e M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, UK; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, Paesi Bassi; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, Paesi Bassi) 'Deposizione di particelle aerotrasportate in sale bianche: calcolo della contaminazione del prodotto e classe di sala bianca richiesta' - Review di aria pulita e contenimento, numero 26, aprile 2016.

[2] W. Whyte, K. Agricola e M. Derks 'Deposizione di particelle aerotrasportate in sale bianche: meccanismi di deposizione' - Review di aria pulita e contenimento – (2015) numero 24, pp. 4-9.

[3] W. Whyte, K. Agricola e M. Derks 'Deposizione di particelle aerotrasportate in sale bianche: relazione tra tasso di deposizione e concentrazione in aria' - Review di aria pulita e contenimento - (2016) numero 25, pp. 4-10.

[4] W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) e T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) 'Velocità di deposizione di particelle microbiche in aria' - European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016; 21(2): 45-49.

Termini e definizioni

Campionatore attivo di microbi dell'aria (Impattore): dispositivo per catturare particelle presenti nell'aria o altri gas tramite collisione con una superficie solida.

Monitoraggio attivo dell'aria: monitoraggio dell'aria ambientale con un campionatore attivo di microbi (Impattore).

Monitoraggio passivo dell'aria: monitoraggio dell'aria ambientale mediante piastre di sedimentazione. Le particelle seguono il flusso d'aria ambientale e cadono sulle piastre di agar.

Particelle organiche: particelle costituite da uno o più microrganismi viventi o che li supportano. [21]