Nepřetržitý monitoring vzdušných mikroorganismů v kritických prostředích

Obrázek 1: Vzorec

Tabulka 2

Obrázek 2: Vzorec

Obrázek 1: Model proudového toku aktivního vzdušného sběrače

Obrázek 2: Geometrie aktivního vzduchového sběrače

Tabulka 3

Gilberto Dalmaso, Ph.D.

Anna Campanella, Ph.D.

Paola Lazzeri

Souhrn

V průběhu více než 10 let jsou v cGMP směrnicích zdůrazňována očekávání týkající se kontinuální mikrobiologické kontroly procesního vzduchu v oblastech třídy A (ISO 5) a třídy B (ISO 7), přičemž je odkazováno na metodu sedimentačních desek. Jelikož však tyto metody spočívají na gravitaci způsobeném dopadu částic na povrch, jsou sedimentační desky považovány za nespolehlivou metodou.

Úvod

Čisté prostory jsou kontrolované oblasti, ve kterých musí být stupeň kontaminace v souladu s definovaným stupněm čistoty. V GMP definovaných čistých prostorách je mikrobiální kontaminace kritickým parametrem, který je třeba kontrolovat. Zajištění sterility pro produkty označené jako sterilní může být dosaženo konečnou sterilizací finálního produktu. Patří sem například velká část sterilních léčiv, která však jsou při běžných sterilizačních procesech nestabilní a vyžadují aseptickou výrobu. Úřady uznávají, že aseptická výroba finálního produktu představuje vyšší riziko kontaminace než konečný sterilizační proces.

Pro snížení tohoto rizika úřady důrazně doporučily farmaceutickým společnostem implementovat řešení, při kterém jsou sterilní produkty odděleny od personálu. To vedlo k zavedení bariérových systémů, jaké jsou dnes běžně používány v sterilní farmaceutické výrobě.

S novými technologiemi je možné kontinuálně a spolehlivě monitorovat stupeň mikrobiální kontaminace v čistém prostoru. Nicméně běžné GMP směrnice pro stanovení mezních hodnot mikrobiální kontaminace stále odkazují na sedimentační desky s 4hodinovým odběrem vzorků a tradiční mikrobiologické metody založené na růstu, které zůstávají nejčastější přístup k monitorování vzduchu. Farmaceutické společnosti převážně používají sedimentační desky pro kontinuální odběr vzorků mikrobiální kontaminace, i když „kontinuální“ sběr jednoho kubíku vzduchu, což je nejběžnější varianta, často netrvá déle než 40 minut. Navíc jsou omezení přirozenou povahou růstových médií, která umožňují pouze krátkodobé mikrobiologické monitorování.

Velikostní rozdělení částic ve vzduchu a účinnost sedimentačních desek

Organické a neorganické částice přenášené vzduchem se liší velikostí, tvarem a hustotou. Bez standardní referenční hodnoty pro přenášené částice jsou používány obecné aproximace, například geometrický ekvivalentní průměr, k určení hodnot velikosti, tvaru a hustoty částice.
Ekvivalentní průměr je v tomto případě průměr koule se stejnou geometrickou vlastností, která se v vzduchu usazuje stejnou rychlostí jako zkoumaná částice. Na základě této odhadu je určena účinnost mikrobiologických monitorovacích metod, tj. jejich schopnost detekce mikroorganismů. Například výnos sedimentační desky byl před několika lety odhadován na základě standardizovaných parametrů pro statické podmínky okolního vzduchu. Tyto parametry však poskytují pouze nedostatečný obraz o kritických prostředích farmaceutických čistých prostor, kde převažují dynamické podmínky (například několik výměn vzduchu za hodinu podle třídy).

Výpočet rychlosti usazování částic ve vzduchu

Ideální kulovitá, nenabitá částice bez zákalu s konstantní rychlostí podle následujícího vzorce (1): viz obrázek 1.

V tomto vzorci je Vc rychlost kontaminace (tj. rychlost usazování mikroorganismů), r f poloměr částice, g f gravitační zrychlení, p f hustota částice, pa hustota vzduchu a ɳ viskozita vzduchu.

Mezi lety 2015 a 2016 vydali Whyte a kol. sérii článků, ve kterých se zabývali usazováním částic přenášených vzduchem na kritické povrchy v čistých prostorách [1-4]. Jako hlavní mechanismy usazování byly identifikovány gravitace, turbulence, elektrostatické přitažlivosti a u částic menších než 0,5 µm také Brownův pohyb. Menší částice jsou pravděpodobněji transportovány vzduchem a mají méně času na usazení, zatímco větší částice se dále usazují vlivem gravitace. Zvýšení turbulence vzduchu může k tomu přispět. U částic velikosti mezi 5 a 30 µm a při použití na ISO třídu 5 se předpokládalo zvýšení rychlosti usazování pětkrát. U částic velikosti 0,3 nebo 0,5 µm se očekávalo menší vliv gravitace.

Zjištěno bylo, že rychlost usazování se s rostoucí čistotou prostoru zvyšuje [4]. Výsledky studie jsou uvedeny v tabulce 2.

Účinnost aktivních vzduchových sběračů mikroorganismů

V příloze B normy ISO 14698:2003 je popsán postup pro stanovení účinnosti sběračů vzdušných mikroorganismů z hlediska dvou aspektů: fyzikální účinnosti a biologické účinnosti.

- Fyzická účinnost je schopnost zachytit různé velikosti částic při odběru vzorků.

- Biologická účinnost je schopnost zachytit částice nesoucí mikroorganismy (MCP).

Fyzická účinnost je stejná pro ne-mikrobiální částice, částice nesoucí mikroorganismy a vzdušné mikroorganismy. Předpokládá se, že biologická účinnost je nižší než fyzikální, protože závisí na přežití zachycených mikroorganismů a na médiu, na kterém dále rostou. Metoda testování popsaná v příloze B se zaměřuje především na fyzikální účinnost.

Experimentální metoda pro stanovení fyzikální účinnosti zahrnuje generování testního aerosolu v testovací komoře (za definované relativní vlhkosti a teploty). Testní aerosol může být vytvořen suspencí spor mikroorganismu Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073), polystyrolovými kuličkami nebo jinými typy neorganických částic. Přestože jsou výsledky podobné, je třeba vzít v úvahu, že u některých sběračů nemusí být všechny anorganické částice rozpoznány. U mikroorganismů však tyto rostou na kolonie, které jsou snadno viditelné a identifikovatelné.

Pro stanovení biologické účinnosti lze použít například Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990), který představuje lidský kontaminační kmen. Vzhledem ke kolísání účinnosti sběru způsobenému stříkáním roztoků a podmínkami sběru je tato metoda považována za méně spolehlivou než metoda stanovení fyzikální účinnosti.

Každý test musí být proveden paralelně s referenčním systémem (membránovým filtrem a vzdušným sběračem mikroorganismů), aby byla zajištěna účinnost sběrače (5): viz obrázek 2.

V příloze A normy ISO 14698:2003 závisí volba vzdušného sběrače mikroorganismů v nebezpečné zóně na účelu odběru vzorků. Navíc by zařízení mělo mít dopadovou rychlost (rychlost vzduchu dopadajícího na kultivační médium), která představuje kompromis mezi:

1. rychlostí dostatečnou k zachycení organických částic do přibližně 1 µm a
2. rychlostí, která nezpůsobí mechanické poškození nebo prasknutí bakteriálních shluků či mikroorganismů.

V oblasti life sciences byla obecná doporučení normy ISO, že sběrač mikroorganismů by měl mít fyzikální výtěžnost kolem 50 % nebo téměř 50 % při velikosti částic přibližně 1 µm (d50 hodnota 1 µm), a sběrače s d50 hodnotou kolem 1 µm jsou široce akceptovány. Pokud je známo, že kontaminační částice v aerosolech mají velikost 10 až 20 µm, proč je důležitý výkon sběrače až do 1 µm? Malé částice jsou obtížněji zachytitelné než větší makropartice (částice větší než 5 µm), a velikost 1 až 3,0 µm odpovídá velikosti nejčastějších jednotlivých bakterií.

Jak jsou částice zachycovány aktivními sběrači mikroorganismů?

Když průtok plynu prochází ostrým změnou směru, částice přenášené tímto proudem mají tendenci, s rostoucím poměrem jejich hmotnosti k jejich lineárním rozměrům, pokračovat ve své původní trajektorii. Částice různých velikostí a hustot následují odlišné dráhy a mohou být zachyceny samostatně. Pokud je proud vzduchu urychlen tryskou, jsou částice přenášené tímto proudem srovnatelné rychlosti s okolním médiem (vzduchem) a následují jeho tok. Pokud se linie proudění u výstupu trysky rychle mění, odlišují se dráhy částic od proudových linií v závislosti na jejich setrvačnosti. Jinými slovy, částice následují přímou čáru, a když narazí na povrch, mohou na něj přilnout a být tak zachyceny.

Aktivní vzduchové sběrače mikroorganismů (impaktory) jsou navrženy tak, aby zachytávaly částice z vzduchu tím, že kolidují s pevnou plochou. Geometrie impaktoru (W, T, S) je navržena tak, aby laminární proudění vstupovalo do trysky (Re < 2300), rychlost byla co nejvyšší a d50 co nejnižší.

Sedimentační desky a jejich alternativa

Sedimentační desky poskytují informace o mikroorganismy nesoucích částicích, jejichž průměr lze odhadnout na více než 10 µm. V příloze C normy ISO 14698-1:2003 je definice sedimentační desky, že pasivní vzdušní sběrače mikroorganismů, například sedimentační desky, neměří celkový počet organických částic ve vzduchu, ale spíše míru, s jakou se organické částice usazují na povrchy.

Sedimentační desky jsou doporučovány pro kontinuální monitorování vzdušných mikroorganismů v kritických oblastech, protože na rozdíl od aktivních sběračů vyžadují pouze omezenou manipulaci. Pro zjednodušení a snížení manipulace při současném snížení rizika kontaminace obsluhy jsou ideální jednorázové impaktory. Pokud výrobce dodržuje požadavky ISO a osvědčené postupy pro laboratoře, mohou být také spolehlivým řešením pro dlouhodobé odběry vzorků.

Porovnání sedimentačních desek s kontinuálním aktivním sběrem vzdušných mikroorganismů

Vzhledem k jejich nízké citlivosti a spornému významu získaných dat se sedimentační desky nedoporučují pro oblasti třídy A. Sedimentační desky jsou povoleny pouze v oblastech tříd B, C a D, kde pohyb vzduchu (turbulence) umožňuje silnější usazování mikroorganismy nesoucích částic.

Při použití moderního vybavení čistých prostor pro personál v aseptických oblastech se očekává přítomnost mikroorganismy nesoucích částic v rozmezí 0,5 až 5 µm. Kontinuální aktivní sběr vzdušných mikroorganismů nahrazuje použití sedimentačních desek a jednotlivé nebo přerušované aktivní sběry vzduchu v oblasti třídy A. V tabulce 3 je uvedeno srovnání metod.

Důvody pro monitorování různých stupňů čistoty

Validace farmaceutických čistých prostor je klíčová pro výrobu léčiv, kde je bezpečnost pacienta zásadní. Mikrobiologická validace určuje, zda je vzduch během výroby čistý. Po validaci a kladném výsledku musí farmaceutické společnosti vypracovat plán monitorování, který dokumentuje a demonstruje kvalitu vzduchu během výroby šarží v souladu se specifikacemi stanovenými při validaci.

Do analýzy rizik monitorování oblastí třídy A (ISO 5 – kritické oblasti) a třídy B (ISO 7) v aseptické výrobě jsou zahrnuty následující body:

- Oblasti třídy A zahrnují produkt, materiály s kontaktem s produktem a kontaktní plochy s okolím. Zvlášť kritické oblasti jsou kontinuálně monitorovány ve všech fázích výroby s vysokou frekvencí vzorkování.
- Oblast třídy B slouží k ochraně prostředí třídy A a vyžaduje přítomnost personálu. V tomto případě má mikrobiologické monitorování jiný význam z hlediska frekvence a mezních hodnot měření. Cílem monitorování v těchto oblastech je kontrola mikrobiální kontaminace v rámci specifikací a validačních výsledků. Mikrobiální trend těchto oblastí by měl být při známé, předvídatelné mikrobiální flóře vždy konstantní nebo mírně klesající.

Kontinuální mikrobiologické monitorování vzduchu v oblasti třídy A je již požadováno směrnicemi cGMP a je implementováno pro celkovou kontrolu částic. Poskytuje důležité informace o množství a velikosti celkových částic přítomných v určitém bodě odběru ve vzduchu. Mezi celkové částice patří:

- inertní částice
- částice s mikroorganismy na površích (bez jejich známého počtu)
- mikroorganismy, které jsou samy částicemi a mohou být detekovány počítačem částicového analyzátoru

Řízení jakosti by mělo mít strategii pro oba oblasti s validovanými metodami (podle farmaceutického zákona nebo mezinárodních standardů), aby podpořilo vyšetřování a umožnilo stanovení potenciální korelace mezi událostmi.

Závěry

V oblastech třídy ISO 5 / třídy A, kde je stanoven proud vzduchu a je vyšší riziko kontaminace, je použití sedimentační desky vzhledem k nízké citlivosti nedostatečnou monitorovací strategií. Sedimentační desky mají větší význam v statických prostředích s malými změnami vzduchu, kde je pravděpodobnější usazování částic a mikroorganismů.

Kontinuální mikrobiologické monitorování vzduchu v kritických oblastech by mělo být dosaženo pomocí validovaných metod, například aktivních vzduchových sběračů mikroorganismů. Tato strategie splňuje požadavky regulačních orgánů na lepší znalost procesu, spolehlivější kontrolu kontaminace a podstatně vyšší sterilitu schváleného produktu.

Autoři

Gilberto Dalmaso, PhD
Globální life science, vědecký vedoucí
Gilberto Dalmaso má více než 25 let zkušeností v oblasti farmaceutické mikrobiologie a sterilizačního zabezpečení, především ve společnosti GlaxoSmithKline (GSK). V roce 2003 jeho laboratoř získala od amerického úřadu FDA ocenění za první schválení v rámci iniciativy PAT pro rychlé mikrobiologické metody (Rapid Microbial Methods, RMM). Gilberto je dnes vědeckým vedoucím pro globální life science v oblasti systémů měření částic; je členem Evropského výboru PDA, mluvčím na řadě sympozií o mikrobiologii a farmaceutickém průmyslu v Evropě, Asii a USA, a je auditorem systémů řízení kvality podle ISO 9001 a HACCP.

Anna Campanella, PhD.
Globální sterilizační zabezpečení a poradenství, systémy měření částic
Anna Campanella, PhD, je odpovědná za globální sterilizační zabezpečení a poradenství v oblasti systémů měření částic. V této funkci využívá své zkušenosti z odvětví k spolupráci s farmaceutickými společnostmi a jejich poradenství, aby vyvíjela a implementovala vědecké strategie, principy monitorování, řízení a zlepšování chemického, fyzikálního a mikrobiologického stavu různých výrobních procesů. Má rozsáhlé zkušenosti v farmaceutickém odvětví, včetně PhD v molekulární medicíně, odbornosti v QA/QC procesech, validaci chemických a mikrobiologických metod, validaci sterilních výrobních procesů a zkušeností s mikrobiologickými aspekty aseptických výrobních procesů.

Paola Lazzeri
GMP specialista v týmu sterilizačního zabezpečení, oblast life sciences
Paola Lazzeri má zkušenosti s podporou farmaceutických společností při kontrole kontaminace, včetně strategií čištění a dezinfekce. Její zkušenosti s výrobci farmaceutických produktů začaly v roce 2005 ve společnosti zabývající se prodejem systémů pro kontrolu kontaminace v čistých prostorách.
Dnes je Paola GMP specialistkou v týmu sterilizačního zabezpečení v oblasti systémů měření částic. V této roli spolupracuje s farmaceutickými společnostmi a radí jim při vývoji a implementaci principů monitorování a kontroly mikrobiální kontaminace prostřednictvím zlepšování vědeckých strategií čištění a dezinfekce.

Seznam literatury

[1] W. Whyte, K. Agricola a M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, UK; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, Nizozemsko; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, Nizozemsko) „Airborne particle deposition in cleanrooms: Calculation of product contamination and required cleanroom class“ - Čistý vzduch a kontaminace, číslo 26, duben 2016.

[2] W. Whyte, K. Agricola a M. Derks „Airborne particle deposition in cleanrooms: Deposition mechanisms“ - Čistý vzduch a kontaminace – (2015) číslo 24, s. 4-9.

[3] W. Whyte, K. Agricola a M. Derks „Airborne particle deposition in cleanrooms: Relationship between deposition rate and airborne concentration“ - Čistý vzduch a kontaminace - (2016) číslo 25, s. 4-10.

[4] W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) a T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) „Deposition velocities of airborne microbe-carrying particles“ - European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016; 21(2): 45-49.

Termíny a definice

Aktivní vzduchový sběrač mikroorganismů (Impaktor): Zařízení pro zachytávání částic ve vzduchu nebo jiných plynů jejich kolizí s pevným povrchem.

Aktivní monitorování vzduchu: Monitorování okolního vzduchu pomocí aktivního sběrače mikroorganismů (Impaktor).

Pasivní monitorování vzduchu: Monitorování okolního vzduchu pomocí sedimentačních desek. Částice následují proudění okolního vzduchu a padají na agarové desky.

Organické částice: Částice složené z jednoho nebo více živých mikroorganismů nebo je podporující. [21]