Stała kontrola mikrobiologiczna powietrza w środowiskach krytycznych

Obraz 1: Wzór

Tabela 2

Obraz 2: Wzór

Rysunek 1: Model przepływu powietrza aktywnego zbieracza zarodników powietrza

Rysunek 2: Geometria aktywnego zbieracza aerozoli

Tabela 3

Gilberto Dalmaso, doktor nauk.

Anna Campanella, dr n. med.

Paola Lazzeri

Podsumowanie

Od ponad 10 lat w wytycznych cGMP podkreśla się oczekiwania dotyczące ciągłego monitorowania mikrobiologicznego powietrza w procesie w klasie A (ISO 5) i klasie B (ISO 7), odwołując się do metody płyt sedimentacyjnych. Jednakże, ponieważ opierają się one na grawitacyjnym opadaniu cząstek na powierzchnię, uważane są za metodę niezwalidowaną.

Wprowadzenie

Czyściwa to kontrolowane obszary, w których stopień zanieczyszczenia musi odpowiadać określonemu poziomowi czystości. W pomieszczeniach GMP zdefiniowanych jako czyste, zanieczyszczenie mikrobiologiczne jest krytycznym parametrem, który należy kontrolować. Zapewnienie sterylności dla produktów oznaczonych jako sterylne może być osiągnięte poprzez końcową sterylizację produktu końcowego. Do tych produktów należą między innymi duża część sterylnych leków, które jednak w standardowych procesach sterylizacji są niestabilne i dlatego wymagają procesów jałowego przetwarzania. Organy uznają, że produkcja jałowa stanowi dla produktu końcowego wyższe ryzyko zanieczyszczenia niż końcowa sterylizacja.

Aby zmniejszyć to ryzyko, organy nadzoru gorąco zaleciły firmom farmaceutycznym wdrożenie rozwiązania, w którym produkty sterylne są oddzielone od personelu. Doprowadziło to do systemów barierowych, które są dziś szeroko stosowane w sterylnych produkcjach farmaceutycznych.

Nowe technologie umożliwiają ciągłe i niezawodne monitorowanie poziomu zanieczyszczeń mikrobiologicznych w czystym pomieszczeniu. Jednakże, obowiązujące wytyczne GMP dotyczące ustalania granic dla zanieczyszczeń mikrobiologicznych nadal odwołują się do metody płyt sedimentacyjnych z 4-godzinnym poborem próbek, a tradycyjne rozwiązania mikrobiologiczne oparte na wzroście pozostają najczęstszym podejściem do monitorowania powietrza. Producenci farmaceutyczni najczęściej używają metod sedimentacyjnych do ciągłego pobierania próbek mikrobiologicznych, nawet jeśli „ciągłe” zbieranie kubika powietrza, najczęstsza metoda, często nie trwa dłużej niż 40 minut. Dodatkowo, naturalne ograniczenia wynikające z mediów wzrostowych często pozwalają na krótkie okresy monitorowania mikrobiologicznego.

Rozkład wielkości cząstek powietrza i skuteczność płyt sedimentacyjnych

Cząstki unoszone w powietrzu, zarówno organiczne, jak i nieorganiczne, różnią się rozmiarem, kształtem i gęstością. Bez standardowej referencji dla cząstek unoszonych w powietrzu, stosuje się ogólne przybliżenia, takie jak geometryczny równoważny średnik, aby uzyskać wartości dotyczące rozmiaru, kształtu i gęstości cząstki.
Równoważny średnik w tym przypadku odpowiada średnicy kuli o tej samej właściwości geometrycznej, która opada w powietrzu z taką samą prędkością jak rozważana cząstka. Na podstawie tego oszacowania określa się skuteczność metod monitorowania mikrobiologicznego, tj. wykrywalność mikroorganizmów. Na przykład, kilka lat temu oszacowano wydajność płyt sedimentacyjnych na podstawie standaryzowanych parametrów dla statycznych warunków otoczenia. Parametry te zapewniają jedynie niewystarczający obraz krytycznych środowisk czystych pomieszczeń farmaceutycznych, w których dominują warunki dynamiczne (np. kilka wymian powietrza na godzinę, w zależności od klasyfikacji).

Obliczanie prędkości opadania cząstek powietrza

Gładka, niezaładowana cząstka kulista bez osadu z trudem opada z prędkością stałą zgodnie z poniższym wzorem (1): patrz Rysunek 1.

Przy tym Vc oznacza prędkość zanieczyszczenia (czyli prędkość opadania jednostki mikrobiologicznej), r f to promień cząstki, g to przyspieszenie ziemskie, p f to gęstość cząstki, pa to gęstość powietrza, a ɳ to lepkość powietrza.

W latach 2015-2016 Whyte i in. opublikowali szereg artykułów, w których zajmowali się osadzaniem się cząstek unoszonych w powietrzu na krytycznych powierzchniach w czystych pomieszczeniach [1-4]. Jako ważne mechanizmy osadzania się cząstek wymieniono opadanie grawitacyjne, turbulencję, przyciąganie elektrostatyczne oraz, dla cząstek poniżej 0,5 µm, ruch Browna. Mniejsze cząstki są z większym prawdopodobieństwem transportowane przez powietrze w czystym pomieszczeniu i mają mniej czasu na osadanie, podczas gdy większe cząstki nadal opadają pod wpływem grawitacji. Wzrost intensywności turbulencji powietrza może to wspierać. Dla cząstek o rozmiarze od 5 do 30 µm i przy zastosowaniu do klasy ISO 5 przyjęto, że prędkość osadzania wzrasta pięciokrotnie. Dla cząstek o rozmiarze 0,3 lub 0,5 µm oczekiwano mniejszego wpływu grawitacji.

Zauważono, że prędkość osadzania wzrasta wraz z czystością czystego pomieszczenia [4]. Wyniki badania przedstawiono w tabeli 2.

Skuteczność aktywnych zbieraczy mikroorganizmów z powietrza

W załączniku B do ISO 14698:2003 opisano metodę określania skuteczności zbierania mikroorganizmów z powietrza pod względem dwóch aspektów: skuteczności fizycznej i skuteczności biologicznej.

- Skuteczność fizyczna to zdolność do wychwytywania różnych rozmiarów cząstek podczas pobierania próbek.

- Skuteczność biologiczna to skuteczność pobierania w zakresie wykrywania cząstek zawierających mikroorganizmy (MCP).

Skuteczność fizyczna jest taka sama dla cząstek nieorganicznych, cząstek zawierających mikroorganizmy i unoszonych mikroorganizmów. Skuteczność biologiczna jest uważana za niższą niż fizyczna, ponieważ zależy od przeżywalności mikroorganizmów zebranych na powierzchni, na której rosną, oraz od medium zbierającego, na którym mogą się rozwijać. Opisana w załączniku B normy metoda testowa koncentruje się głównie na skuteczności fizycznej.

Eksperymentalna metoda określania skuteczności fizycznej obejmuje aerozol testowy, który jest generowany i rozpraszany w komorze testowej (przy określonej wilgotności względnej i temperaturze). Aerozol testowy może być wytwarzany z zawiesiny sporowej Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073), kulek polistyrenowych lub innych rodzajów cząstek nieorganicznych. Pomimo podobnych wyników, należy pamiętać, że niektóre zbieracze mogą nie wykrywać wszystkich cząstek nieorganicznych. W przypadku mikroorganizmów, te rosną w kolonie, które są łatwo widoczne i rozpoznawalne.

Do określenia skuteczności biologicznej można użyć Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990), który reprezentuje ludzką szczepionkę zanieczyszczenia. Ze względu na wahania skuteczności zbierania, spowodowane podaniem roztworów i warunkami zbierania, ta metoda jest uważana za mniej niezawodną niż metoda określania skuteczności fizycznej.

Każdy test musi być przeprowadzony równolegle z systemem referencyjnym (filtr membranowy i zbieracz mikroorganizmów z powietrza), aby ocenić skuteczność zbieracza próbek (5): patrz Rysunek 2.

W ISO 14698:2003 załącznik A wybór zbieracza mikroorganizmów z powietrza do użytku w strefach zagrożenia zależy od celu pobierania próbek. Ponadto urządzenie powinno mieć prędkość uderzenia (prędkość powietrza uderzającego w medium hodowlane), która stanowi kompromis pomiędzy:

1. prędkością wystarczająco wysoką, aby wychwycić organiczne cząstki o rozmiarze do około 1 µm oraz
2. prędkością nie za wysoką, aby zapewnić żywotność cząstek, unikając mechanicznych uszkodzeń lub pęknięcia skupisk bakterii czy mikromicetów.

W branży nauk życiowych ogólnie zalecano zbieracze mikroorganizmów z skutecznością fizyczną około 50% lub bliską temu przy rozmiarze cząstek około 1 µm (wartość d50 1 µm), a zbieracze o d50 około 1 µm są szeroko akceptowane. Jeśli wiadomo, że cząstki zawierające mikroorganizmy w aerozolach mają rozmiar od 10 do 20 µm, dlaczego ważne jest dobre działanie do 1 µm? Małe cząstki są trudniejsze do wychwycenia niż większe makropartikel (cząstki powyżej 5 µm), a rozmiar 1-3 µm odpowiada najczęstszym pojedynczym bakteriom.

Jak zbierają cząstki aktywne zbieracze mikroorganizmów?

Gdy strumień gazu przechodzi przez ostrą zmianę kierunku, cząstki transportowane mają tendencję do poruszania się wzdłuż swojej pierwotnej trajektorii, w miarę wzrostu stosunku masy do wymiarów liniowych. Cząstki o różnych rozmiarach i gęstościach podążają różnymi torami i mogą być zbierane oddzielnie. Gdy strumień powietrza jest przyspieszany w dyszy, cząstki transportowane z nim są przemieszczane z taką samą prędkością jak otaczające medium (powietrze) i podążają za linią przepływu. Gdy linie przepływu w dyszy szybko się zmieniają na wyjściu, trajektorie cząstek różnią się wyraźnie od linii przepływu w zależności od ich bezwładności. Innymi słowy, cząstki podążają prostą linią, a gdy napotykają powierzchnię na swojej drodze, mogą się do niej przyczepić i zostać w ten sposób zebrane.

Aktywne zbieracze mikroorganizmów z powietrza (impaktory) są zaprojektowane tak, aby zbierać cząstki z powietrza poprzez kolizję z twardą powierzchnią. Geometria impaktora (W, T, S) jest tak dobrana, aby laminarne przepływy powietrza w dyszy (Re < 2300) zapewniały jak najwyższą prędkość i jak najniższą wartość d50.

Płyty sedimentacyjne i alternatywy

Płyty sedimentacyjne dostarczają informacji o cząstkach zawierających mikroorganizmy, których średni rozmiar można szacować na ponad 10 µm. W ISO 14698-1:2003 załącznik C, definicja płyty sedimentacyjnej mówi, że pasywne zbieracze mikroorganizmów z powietrza, takie jak płyty sedimentacyjne, nie mierzą całkowitej liczby cząstek organicznych w powietrzu, lecz raczej szybkość, z jaką cząstki organiczne osadzają się na powierzchniach.

Płyty sedimentacyjne są zalecane do ciągłego monitorowania mikrobiologicznego powietrza w obszarach krytycznych, ponieważ w przeciwieństwie do aktywnych zbieraczy wymagają ograniczonej obsługi. Aby uprościć i zmniejszyć obsługę przy jednoczesnym ograniczeniu ryzyka zanieczyszczenia operatora, idealną alternatywą są jednorazowe impaktory. Pod warunkiem, że producent przestrzega wymagań ISO i najlepszych praktyk laboratoryjnych, mogą one również stanowić niezawodne rozwiązanie do długoterminowego pobierania próbek.

Płyty sedimentacyjne a ciągłe aktywne zbieranie mikroorganizmów z powietrza

Z powodu niskiej czułości i wątpliwego znaczenia uzyskanych danych, płyty sedimentacyjne nie są zalecane w obszarach klasy A. Płyty sedimentacyjne są dozwolone tylko w obszarach klas B, C i D, gdzie ruch powietrza (turbulencje) umożliwia silniejsze osadzanie się cząstek zawierających mikroorganizmy.

W przypadku nowoczesnego sprzętu do czystych pomieszczeń dla personelu w obszarach aseptycznych oczekuje się cząstek zawierających mikroorganizmy w zakresie od 0,5 do 5 µm. Ciągłe aktywne zbieranie mikroorganizmów z powietrza zastępuje użycie płyt sedimentacyjnych oraz pojedyncze lub przerywane aktywne zbieranie mikroorganizmów z powietrza w obszarach klasy A. W tabeli 3 przedstawiono porównanie metod.

Powody monitorowania różnych poziomów czystości

Walidacja czystości pomieszczeń farmaceutycznych jest kluczowa dla produkcji leków, w których bezpieczeństwo pacjenta odgrywa główną rolę. Poprzez walidację mikrobiologiczną ustala się, czy powietrze jest czyste podczas produkcji. Po walidacji i pozytywnym wyniku, firmy farmaceutyczne muszą opracować plan monitorowania, który dokumentuje i demonstruje jakość powietrza podczas produkcji partii zgodnie z ustalonymi specyfikacjami, opartymi na walidacji.

W analizie ryzyka monitorowania obszarów klasy A (ISO 5 – krytyczne obszary) i klasy B (ISO 7) uwzględnia się następujące punkty:

- Obszary klasy A obejmują produkt, materiały kontaktujące się z produktem oraz powierzchnie kontaktowe z otoczeniem. Szczególnie krytyczne obszary są monitorowane ciągle i z wysoką częstotliwością powietrza we wszystkich etapach produkcji.
- Obszar klasy B służy do ochrony środowisk klasy A i wymaga obecności personelu. W tym przypadku mikrobiologiczna kontrola ma inne znaczenie dla częstotliwości i granic pomiarów. Celem monitorowania w tych obszarach jest kontrola mikrobiologicznego zanieczyszczenia w ramach specyfikacji i wyników walidacji. Trend mikrobiologiczny tych obszarów musi być zawsze stabilny lub lekko malejący, przy znanej i przewidywalnej florze mikroorganizmów.

Ciagłe mikrobiologiczne monitorowanie powietrza w klasie A jest już wymagane przez wytyczne cGMP i wdrożone w ramach monitorowania cząstek ogółem. Dostarcza ono ważnych informacji o ilości i rozmiarze ogólnych cząstek obecnych w powietrzu w określonym punkcie pobierania próbek. Do ogólnych cząstek należą:

- Cząstki obojętne
- Cząstki z mikroorganizmami na powierzchniach (bez znanej ilości)
- Mikroorganizmy, które same są cząstkami i mogą być wykryte przez licznik cząstek

Zapewnienie jakości powinno obejmować strategię dla obu obszarów z metodami zwalidowanymi (zgodnie z Farmakopeą lub międzynarodowymi standardami), aby wspierać badania i umożliwić określenie potencjalnej korelacji między zdarzeniami.

Wnioski

W obszarach ISO 5/Klasa A, gdzie przepływ powietrza jest ustalony, a ryzyko zanieczyszczenia jest wyższe, stosowanie płyty sedimentacyjnej ze względu na jej niską czułość jest niewystarczającą strategią monitorowania. Płyty sedimentacyjne mają większe znaczenie w statycznych środowiskach z niewielkimi zmianami powietrza, gdzie osadzanie się cząstek i mikroorganizmów jest bardziej prawdopodobne.

Stałe monitorowanie mikrobiologiczne powietrza w obszarach krytycznych powinno być realizowane za pomocą zwalidowanych metod, takich jak aktywne zbieracze mikroorganizmów z powietrza. Ta strategia spełnia wymogi organów nadzoru dotyczące lepszej znajomości procesu, bardziej niezawodnej kontroli zanieczyszczeń i znacznie wyższej pewności sterylności dla produktu zatwierdzonego.

Autorzy

Gilberto Dalmaso, PhD
Global Life Science, kierownik naukowy
Gilberto Dalmaso posiada ponad 25 lat doświadczenia w mikrobiologii farmaceutycznej i zapewnieniu sterylności, głównie w firmie GlaxoSmithKline (GSK). W 2003 roku jego laboratorium otrzymało od amerykańskiej agencji zdrowia FDA wyróżnienie za pierwszą na świecie akredytację w ramach inicjatywy PAT dla szybkich metod mikrobiologicznych (Rapid Microbial Methods, RMM). Obecnie Gilberto jest kierownikiem naukowym ds. systemów pomiaru cząstek w Global Life Science; jest członkiem Europejskiego Komitetu PDA, prelegentem na licznych sympozjach dotyczących mikrobiologii i przemysłu farmaceutycznego w Europie, Azji i USA oraz audytorem systemów jakości zgodnie z ISO 9001 i HACCP.

Anna Campanella, PhD.
Globalna zapewnienie sterylności i doradztwo, systemy pomiaru cząstek
Anna Campanella, PhD, jest odpowiedzialna za globalne zapewnienie sterylności i doradztwo w zakresie systemów pomiaru cząstek. W tej roli wykorzystuje swoje doświadczenie branżowe, współpracując z firmami farmaceutycznymi i doradzając im, aby opracować i wdrożyć strategie naukowe, zasady monitorowania, sterowania i poprawy stanu chemicznego, fizycznego i mikrobiologicznego różnych procesów produkcyjnych. Posiada szerokie doświadczenie w branży farmaceutycznej, w tym doktorat z medycyny molekularnej, wiedzę w zakresie QA & QC, walidacji metod chemicznych i mikrobiologicznych, walidacji procesów produkcji sterylnej oraz doświadczenie w mikrobiologicznych aspektach procesów produkcji aseptycznej.

Paola Lazzeri
Specjalistka GMP w zespole ds. zapewnienia sterylności, obszar nauk o życiu
Paola Lazzeri posiada doświadczenie we wspieraniu firm farmaceutycznych w zakresie kontroli zanieczyszczeń, w tym strategii czyszczenia i dezynfekcji. Jej doświadczenie z producentami farmaceutycznymi rozpoczęło się w 2005 roku w firmie zajmującej się sprzedażą systemów kontroli zanieczyszczeń w czystych pomieszczeniach.
Obecnie Paola jest specjalistką GMP w zespole ds. zapewnienia sterylności w zakresie systemów pomiaru cząstek. W tej roli współpracuje z firmami farmaceutycznymi, doradzając im w zakresie rozwoju i wdrażania zasad monitorowania i kontroli mikrobiologicznego zanieczyszczenia poprzez ulepszanie naukowych strategii czyszczenia i dezynfekcji.

Literatura

[1] W. Whyte, K. Agricola i M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, UK; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, Holandia; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, Holandia) 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Calculation of product contamination and required cleanroom class' - Clean Air and Containment Review, numer 26, kwiecień 2016.

[2] W. Whyte, K. Agricola i M. Derks 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Deposition mechanisms' - Clean Air and Containment Review – (2015) numer 24, s. 4-9.

[3] W. Whyte, K. Agricola i M. Derks 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Relationship between deposition rate and airborne concentration' - Clean Air and Containment Review - (2016) numer 25, s. 4-10.

[4] W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) i T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) 'Deposition velocities of airborne microbe-carrying particles' - European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016; 21(2): 45-49.

Terminy i definicje

Aktywny zbieracz mikroorganizmów z powietrza (Impaktor): Urządzenie do wychwytywania cząstek w powietrzu lub innych gazach poprzez ich kolizję z twardą powierzchnią.

Aktywne monitorowanie powietrza: Monitorowanie otoczenia za pomocą aktywnego zbieracza mikroorganizmów (Impaktora).

Pasywne monitorowanie powietrza: Monitorowanie otoczenia za pomocą płyt sedimentacyjnych. Cząstki podążają za strumieniem powietrza i opadają na płytki agarowe.

Cząstki organiczne: Cząstki składające się z jednego lub więcej żywych mikroorganizmów lub je wspierające. [21]