Continuele luchtverontreinigingsmonitoring in kritieke omgevingen

Afbeelding 1: Formule

Tabel 2

Afbeelding 2: Formule

Figuur 1: Luchtstroommodel van een actieve luchtbevochtiger

Figuur 2: Geometrie van de actieve luchtmonstervoorziening

Tabel 3

Gilberto Dalmaso, PhD.

Anna Campanella, PhD.

Paola Lazzeri

Samenvatting

Al meer dan 10 jaar worden in cGMP-richtlijnen de verwachtingen met betrekking tot de continue microbiologische procesluchtbewaking in klasse A- (ISO 5) en klasse B- (ISO 7) gebieden benadrukt, waarbij wordt verwezen naar de sedimentatieplaatmethode. Aangezien deze echter gebaseerd is op het door zwaartekracht veroorzaakte neerslaan van deeltjes op een oppervlak, worden sedimentatieplaten beschouwd als een niet-valideerbare methode.

Inleiding

Schone kamers zijn gecontroleerde gebieden waarin de mate van besmetting moet voldoen aan een gedefinieerde zuiverheidsgraad. In GMP-gedefinieerde cleanrooms is microbiële besmetting een kritische parameter die gecontroleerd moet worden. De steriliteitssicherung voor als steril gekenmerkte producten kan worden bereikt door een eindsterilisatie van het eindproduct. Tot deze producten behoren onder andere een groot deel van steriele geneesmiddelen, die echter in de gebruikelijke sterilisatieprocessen instabiel zijn en daarom aseptische verwerking vereisen. De autoriteiten erkennen dat aseptische productie voor het eindproduct een hoger besmettingsrisico met zich meebrengt dan het eindsterilisatieproces.

Om dit risico te verminderen, hebben de toezichthoudende instanties farmaceutische bedrijven dringend aanbevolen een oplossing te implementeren waarbij steriele producten gescheiden worden van het personeel. Dit heeft geleid tot barrièresystemen zoals die tegenwoordig veel voorkomen in steriele farmaceutische productie.

Met nieuwe technologieën is het mogelijk om het niveau van microbiële besmetting in de cleanroom continu en betrouwbaar te bewaken. Echter, de gangbare GMP-richtlijnen voor het bepalen van grenswaarden voor microbiële verontreinigingen blijven verwijzen naar de sedimentatieplaat met een bemonsteringsduur van 4 uur, en traditionele, op groei gebaseerde microbiologische oplossingen blijven de meest gebruikte aanpak voor luchtbewaking. Farmaceutische fabrikanten gebruiken vooral sedimentatieplaten voor de continue bemonstering van microbiële besmetting, zelfs als de 'continue' verzameling van een kubieke meter lucht, de meest voorkomende variant, vaak niet langer dan 40 minuten duurt. Daarbij komt dat natuurlijke beperkingen door groeimedia vaak slechts korte microbiële bewakingsperioden toelaten.

Grootteverdeling van luchtdeeltjes en effectiviteit van sedimentatieplaten

Organische en niet-organische luchtdeeltjes variëren in grootte, vorm en dichtheid. Zonder een standaardreferentie voor luchtdeeltjes worden algemene benaderingen zoals de geometrische equivalente diameter gebruikt om waarden voor de grootte, vorm en dichtheid van een deeltje te verkrijgen.
De equivalente diameter komt in dit geval overeen met de diameter van een bol met dezelfde geometrische eigenschappen die in de lucht met dezelfde snelheid neerdaalt als het beschouwde deeltje. Op basis van deze schatting wordt de effectiviteit van microbiële bewakingsmethoden, dat wil zeggen de terugwinning van micro-organismen, bepaald. Bijvoorbeeld, de opbrengst van de sedimentatieplaat werd enkele jaren geleden geschat op basis van gestandaardiseerde parameters voor statische omstandigheden van de omgevingslucht. Deze parameters bieden echter een onvoldoende representatie van kritische farmaceutische cleanroomomgevingen waarin dynamische omstandigheden heersen (bijvoorbeeld meerdere luchtwisselingen per uur afhankelijk van de classificatie).

Berekening van de neerwaartse snelheid van luchtdeeltjes

Een bolvormig, ongeladen deeltje zonder troebel sediment met een constante snelheid volgens de volgende formule (1): zie afbeelding 1.

Hierbij staat Vc voor de besmettingssnelheid (d.w.z. de neerwaartse snelheid van een KbE), r voor de deeltje-radius, g voor de zwaartekrachtversnelling, p voor de deeltjesdichtheid, pa voor de luchtdichtheid en ɳ voor de viscositeit van de lucht.

Tussen 2015 en 2016 publiceerden Whyte et al. een reeks artikelen waarin zij zich bezighielden met de afzetting van luchtgedragen deeltjes op kritische oppervlakken in cleanrooms [1-4]. Als belangrijke mechanismen voor de afzetting werden gravitatieafzetting, turbulentieafzetting, elektrostatische aantrekking en bij deeltjes onder 0,5 µm, de brownsche beweging vastgesteld. Kleinere deeltjes worden waarschijnlijker uit de cleanroom getransporteerd en krijgen nauwelijks tijd om neer te slaan, terwijl grotere deeltjes zich nog steeds door zwaartekracht afzetten. Een toename in de intensiteit van de lucht turbulentie kan hierbij helpen. Bij een deeltjesgrootte tussen 5 en 30 µm en toepassing op een ISO-klasse 5 werd uitgegaan van een verhoging van de afzettingssnelheid met een factor vijf. Voor deeltjes van 0,3 of 0,5 µm werd een minder grote invloed van zwaartekracht verwacht.

Het werd vastgesteld dat de afzettingssnelheid toeneemt naarmate de zuiverheid van de cleanroom toeneemt [4]. De resultaten van de studie zijn weergegeven in tabel 2.

Efficiëntie van actieve luchtmicrobiële verzamelaars

In ISO 14698:2003 Bijlage B wordt een methode beschreven om de verzamelsefficiëntie van luchtmicrobiële verzamelaars te bepalen met betrekking tot twee aspecten: de fysieke efficiëntie en de biologische efficiëntie.

- De fysieke efficiëntie is het vermogen om tijdens de bemonstering verschillende deeltjesgroottes te detecteren.

- De biologische efficiëntie is de efficiëntie van de bemonstering met betrekking tot de terugwinning van kiemdragende deeltjes (MCP).

De fysieke efficiëntie is gelijk voor niet-microbiële deeltjes, kiemdragende deeltjes en luchtgedragen kiemen. De biologische efficiëntie wordt als lager aangenomen dan de fysieke efficiëntie, omdat deze afhankelijk is van het overleven van de verzamelde micro-organismen en van het verzamelsmedium waarop zij vervolgens groeien. De in Bijlage B beschreven testmethode richt zich vooral op de fysieke efficiëntie.

De experimentele methode om de fysieke efficiëntie te bepalen omvat een testaerosol dat wordt gegenereerd en verstrooid in een testkamer (bij bepaalde relatieve luchtvochtigheid en temperatuur). Het testaerosol kan worden gegenereerd met Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073)-sporen suspensie, door polystyrolbolletjes of andere soorten niet-organische deeltjes. Ondanks vergelijkbare resultaten moet worden opgemerkt dat niet alle anorganische deeltjes door sommige verzamelaars worden herkend. Bij gebruik van micro-organismen daarentegen groeien deze uit tot kolonies die gemakkelijk zichtbaar en identificeerbaar zijn.

Voor de bepaling van de biologische efficiëntie kan Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990) worden gebruikt, waarmee een menselijke besmettingsstam kan worden weergegeven. Vanwege de variaties in de verzamelsefficiëntie, veroorzaakt door het inspuiten van oplossingen en de verzamingsomstandigheden, wordt deze methode als minder betrouwbaar beschouwd dan de methode voor de bepaling van de fysieke efficiëntie.

Elke test moet parallel worden uitgevoerd met een referentiesysteem (membraanfilter en luchtmicrobiële verzamelaar) om de efficiëntie van de monstersampler te bepalen (5): zie afbeelding 2.

In ISO 14698:2003 Bijlage A hangt de keuze van de in een gevaarlijke zone te gebruiken luchtmicrobiële verzamelaar af van het doel van de bemonstering. Bovendien moet het apparaat een inslag- of botsingssnelheid (snelheid van de lucht die op het cultuurmedium treft) hebben die een compromis vormt tussen:

1. een snelheid die zo hoog is dat het het detecteren van organische deeltjes tot ongeveer 1 µm mogelijk maakt en
2. een snelheid die niet te hoog is, zodat de levensvatbaarheid van de deeltjes behouden blijft, door mechanische schade of het breken van bacterieklonten of microbiële conglomeraten te voorkomen.

In de Life Science-sector was de aanbeveling van de ISO-standaard over het algemeen een kiemverzamelaar met een fysieke opbrengst van of bijna 50% bij een deeltjesgrootte van ongeveer 1 µm (d50-waarde van 1 µm), en kiemverzamelaars met een d50-waarde van ongeveer 1 µm worden algemeen erkend. Als bekend is dat kiemdragende deeltjes in aerosolen een grootte hebben van 10 tot 20 µm, waarom is een goede prestatie tot 1 µm dan belangrijk? Kleine deeltjes zijn moeilijker op te vangen dan grotere macrodeeltjes (deeltjes groter dan 5 µm), en 1 tot 3,0 µm komt overeen met de grootte van de meest voorkomende enkelvoudige bacteriën.

Hoe worden deeltjes door actieve kiemverzamelaars opgevangen?

Wanneer een gasstroom een scherpe richtingsverandering ondergaat, neigen de deeltjes die worden getransporteerd, naarmate de verhouding van hun massa tot hun lineaire afmetingen toeneemt, zich verder te bewegen in hun oorspronkelijke richting. Deeltjes met verschillende afmetingen en dichtheden volgen verschillende banen en kunnen afzonderlijk worden verzameld. Wanneer een luchtstraal wordt versneld in een nozzle, worden de door hem getransporteerde deeltjes met dezelfde snelheid als het omringende medium (lucht) voortgestuwd en volgen ze de stroomlijn. Wanneer de stromingslijnen snel veranderen bij de uitgang van de nozzle, scheiden de banen van de deeltjes zich duidelijk af van de luchtstromingslijnen, afhankelijk van de traagheid van de deeltjes. Anders gezegd, de deeltjes volgen een rechte lijn en kunnen zich aan een oppervlak hechten en zo worden opgevangen.

Actieve luchtmicrobiële verzamelaars (impactatoren) zijn zo ontworpen dat ze deeltjes uit de lucht opnemen door deze te laten botsen op een vast oppervlak. De geometrie van de impactor (W, T, S) is zodanig dat laminaire stroming in de nozzle (Re < 2300) plaatsvindt, de snelheid zo hoog mogelijk is en de d50-waarde zo laag mogelijk ligt.

Sedimentatieplaten en het alternatief

Sedimentatieplaten geven aanwijzingen over microbieel dragende deeltjes, waarvan wordt aangenomen dat de gemiddelde diameter meer dan 10 µm bedraagt. In ISO 14698-1:2003 Bijlage C wordt de definitie van de sedimentatieplaat gegeven dat passieve luchtmicrobiële verzamelaars zoals bijvoorbeeld sedimentatieplaten niet het totale aantal organische deeltjes in de lucht meten, maar vooral de snelheid waarmee organische deeltjes zich op oppervlakken afzetten.

Sedimentatieplaten worden aanbevolen voor continue luchtmicrobiële bewaking in kritische gebieden, omdat ze in tegenstelling tot actieve microbiële verzamelaars slechts beperkte hantering vereisen. Voor vereenvoudiging en het verminderen van de hantering, terwijl het besmettingsrisico voor de operator wordt verminderd, vormen wegwerpartikelsystemen de ideale oplossing. Zolang de fabrikant voldoet aan de ISO-eisen en best practices voor laboratoria, kunnen ze ook een betrouwbare oplossing vormen voor langdurige bemonstering.

Vergelijking sedimentatieplaten en continue actieve luchtmicrobiële verzameling

Vanwege hun geringe gevoeligheid en de twijfelachtige betekenis van de resulterende gegevens worden sedimentatieplaten niet aanbevolen voor gebieden van klasse A. Sedimentatieplaten zijn alleen toegestaan in gebieden van klasse B, C en D, waar de luchtbeweging (turbulentie) een sterkere afzetting van kiemdragende deeltjes mogelijk maakt.

Bij gebruik van moderne cleanroomkleding voor personeel in aseptische gebieden worden kiemdragende deeltjes verwacht in een groottebereik van 0,5 tot 5 µm. De continue actieve luchtmicrobiële verzameling vervangt het gebruik van sedimentatieplaten en de enkele of intermitterende actieve luchtmicrobiële verzameling voor klasse A-gebieden. In tabel 3 wordt de methodenvergelijking weergegeven.

Redenen voor bewaking van verschillende zuiverheidsgraden

De kwalificatie van farmaceutische cleanrooms is van cruciaal belang voor de productie van geneesmiddelen waarin de patiëntveiligheid een centrale rol speelt. Door microbiologische kwalificatie wordt vastgesteld of de lucht tijdens de productie schoon is. Na de kwalificatie en een positief resultaat moeten farmaceutische bedrijven binnen hun contaminatiecontrole-strategie een bewakingsplan ontwikkelen dat de luchtkwaliteit tijdens de batchproductie documenteert en aantoont volgens de specificaties die tijdens de validatie zijn vastgesteld.

De risicoanalyse voor de bewaking van gebieden van klasse A (ISO 5-kritische gebieden) en klasse B (ISO 7) in de aseptische productie omvat de volgende punten:

- Gebieden van klasse A omvatten het product, materialen in contact met het product en contactvlakken met de omgeving. Ze worden in alle productiefasen continu en met hoge luchtfrequenties bewaakt.
- Het gebied van klasse B dient ter bescherming van klasse A-omgevingen en vereist aanwezigheid van personeel. In dit geval heeft microbiële bewaking een andere betekenis voor de frequentie en de grenswaarden van de metingen. Het doel van de bewaking in deze gebieden is het controleren van microbiële besmetting binnen de specificaties en kwalificatie-uitkomsten. De microbiële trend in deze gebieden moet altijd constant of licht afnemend zijn bij bekende, voorspelbare microbenflora.

Een continue microbiële luchtbewaking in klasse A wordt al geëist door cGMP-richtlijnen en geïmplementeerd voor de totale deeltjesmonitoring. Het levert belangrijke informatie over de hoeveelheid en grootte van de totale deeltjes die op een bepaald bemonsteringspunt in de lucht aanwezig zijn. Tot de totale deeltjes behoren:

- Inerte deeltjes
- Deeltjes met micro-organismen op hun oppervlakken (zonder hun bekende aantal)
- Micro-organismen die zelf deeltjes zijn en daarom door de deeltjesdetector kunnen worden herkend

De kwaliteitsborging moet een strategie hebben voor beide gebieden met gevalideerde methoden (volgens de Farmacopee of internationale normen) om onderzoeken te ondersteunen en de mogelijkheid tot het vaststellen van een potentiële correlatie tussen gebeurtenissen te faciliteren.

Conclusies

In gebieden van ISO 5/Klasse A, waar de luchtstroom vastligt en het besmettingsrisico hoger is, betekent het gebruik van een sedimentatieplaat vanwege de lage gevoeligheid slechts een onvoldoende bewakingsstrategie. Sedimentatieplaten hebben een grotere betekenis in statische omgevingen met geringe luchtveranderingen, waar de afzetting van deeltjes en micro-organismen waarschijnlijker is.

Een continue luchtkiemmonitoring in kritische gebieden moet worden bereikt met gevalideerde methoden zoals bijvoorbeeld actieve luchtmicrobiële verzamelaars. Deze strategie voldoet aan de eisen van toezichthouders voor betere proceskennis, een betrouwbaardere contaminatiecontrole en een aanzienlijk hogere sterilisatieveiligheid voor het vrijgegeven product.

Auteurs

Gilberto Dalmaso, PhD
Global Life Science, wetenschappelijk directeur
Gilberto Dalmaso beschikt over meer dan 25 jaar ervaring in farmaceutische microbiologie en steriliteitssicherung, voornamelijk bij GlaxoSmithKline (GSK). In 2003 ontving zijn laboratorium van de Amerikaanse gezondheidsautoriteit FDA de erkenning als ’s werelds eerste goedkeuring binnen het PAT-initiatief voor snelle microbiële methoden (Rapid Microbial Methods, RMM). Gilberto is momenteel wetenschappelijk directeur voor Global Life Science voor deeltjesmeetsystemen; hij is lid van het European PDA Committee, spreker op talrijke symposia over microbiologie en farmacie in Europa, Azië en de VS, en kwaliteitsysteemauditor volgens ISO 9001 en HACCP.

Anna Campanella, PhD.
Wereldwijde steriliteitssicherung en advies, deeltjesmeetsystemen
Anna Campanella, PhD, is verantwoordelijk voor de wereldwijde steriliteitssicherung en advies met betrekking tot deeltjesmeetsystemen. In deze functie gebruikt ze haar branche-ervaring om samen te werken met farmaceutische bedrijven en hen te adviseren, zodat wetenschappelijke strategieën, principes van bewaking, controle en verbetering van de chemische, fysieke en microbiologische toestand van verschillende productieprocessen kunnen worden ontwikkeld en geïmplementeerd. Ze beschikt over uitgebreide ervaring in de farmaceutische sector, waaronder een PhD in moleculaire geneeskunde, expertise in QA & QC-processen, validatie van chemische en microbiologische methoden, validatie van steriele productieprocessen en ervaring met microbiologische aspecten van aseptische productieprocessen.

Paola Lazzeri
GMP-specialist in het team voor steriliteitssicherung, afdeling Life Sciences
Paola Lazzeri heeft ervaring in het ondersteunen van farmaceutische bedrijven bij contaminatiecontrole, inclusief reinigings- en desinfectiestrategieën. Haar ervaring met farmaceutische producenten begon in 2005 bij een distributeur van cleanroom-contaminatiecontrolesystemen.
Vandaag is Paola GMP-specialist van het team voor steriliteitssicherung met betrekking tot deeltjesmeetsystemen. In deze rol werkt ze samen met farmaceutische bedrijven en adviseert ze hen bij het ontwikkelen en implementeren van principes voor bewaking en controle van microbiële besmetting door het verbeteren van wetenschappelijke reinigings- en desinfectiestrategieën.

Literatuurlijst

[1] W. Whyte, K. Agricola en M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, VK; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, Nederland; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, Nederland) 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Calculation of product contamination and required cleanroom class' - Clean Air and Containment Review, editie 26, april 2016.

[2] W. Whyte, K. Agricola en M. Derks 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Deposition mechanisms' - Clean Air and Containment Review – (2015) editie 24, p. 4-9.

[3] W. Whyte, K. Agricola en M. Derks 'Airborne particle deposition in cleanrooms: Relationship between deposition rate and airborne concentration' - Clean Air and Containment Review - (2016) editie 25, p. 4-10.

[4] W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) en T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) 'Deposition velocities of airborne microbe-carrying particles' - European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016; 21(2): 45-49.

Termen en definities

Actieve luchtmicrobiële verzamelaar (Impactor): Apparaat voor het opvangen van deeltjes in de lucht of andere gassen door botsing met een vast oppervlak.

Actieve luchtmicrobiële verzameling: Bewaking van de omgeving lucht met een actieve microbiële verzamelaar (impactor).

Passieve luchtbewaking: Bewaking van de omgeving lucht met behulp van sedimentatieplaten. De deeltjes volgen de omgeving luchtstroom en vallen op de agarplaten.

Organische deeltjes: Deeltjes die bestaan uit een of meerdere levende micro-organismen of deze ondersteunen. [21]