Kritische Mutationen

Schematische Darstellung der vier funktionsbestimmenden strukturellen Unterschiede zwischen enzymatisch aktiven und inaktiven Glutaredoxinen.

Vergelijking van de vier functioneel bepalende structurele verschillen tussen enzymatisch actieve en inactieve glutaredoxines.

Deutsche onderzoekers konden de exacte structurele verschillen achterhalen die bepalend zijn voor of een eiwit een actief enzym wordt of een raamwerk voor ijzionen. Deze bevinding, die wordt gerapporteerd in het vakblad Nature Communications, biedt een dieper inzicht in fundamentele cellulaire processen zoals DNA-synthese en ijzermetabolisme.

Vier mutaties in een groep eiwitten die glutaredoxines worden genoemd, bepalen hoe de eiwitten functioneren in verschillende gebieden zoals bacteriën, gist, planten tot aan de mens, melden onderzoekers in het vakblad Nature Communications.

“Deze eiwitten zijn van cruciaal belang voor levensbelangrijke stofwisselingsroutes,” verklaarde professor Marcel Deponte, die als biochemicus het onderzoek aan de Technische Universiteit Kaiserslautern leidde. “De verkregen inzichten over de eiwitten vergroten ons fundamenteel begrip van hoe het leven werkt.”

Er zijn twee hoofdklassen van glutaredoxine-eiwitten. Glutaredoxines van klasse I zijn enzymen die belangrijke redoxreacties katalyseren, zoals bijvoorbeeld de synthese van de uitgangsverbindingen van DNA. Glutaredoxines van klasse II zijn geen actieve katalysatoren, maar dienen als dragers en sensoren voor ijzer-sulfide-kringen, die een belangrijke rol spelen in het ijzermetabolisme.

Hoewel biochemici de twee klassen al meer dan 20 jaar kennen, was het tot nu toe onduidelijk welke structurele verschillen verantwoordelijk zijn voor de verschillende functies. Marcel Deponte sloot zich aan bij onderzoekers van de Universiteit van Saarland en de Heinrich-Heine-Universiteit Düsseldorf om de eiwitten in reageerbuis, in gistcellen en in door computers ondersteunde modelleringen te bestuderen.

Kernmagnetische resonantie-structuren van de eiwitten toonden vier gebieden aan die verschillen of mutaties bevatten tussen de aminozuurvolgordes van klasse I en klasse II. Marcel Deponte en zijn medewerkers wilden precies weten hoeveel elke mutatie bijdraagt aan het omvormen van het eiwit tot een catalytisch actief glutaredoxin van klasse I of tot een inactief glutaredoxin van klasse II.

Om dit te meten, gebruikten ze een combinatie van bewerking- en tracetechnieken. In de eerste stap werden de eiwitten geproduceerd en gereinigd om hun activiteit in een reageerbuisassay te kunnen analyseren. Normaal gesproken zou een actief enzym van klasse I een redoxreactie katalyseren of ondersteunen, dat wil zeggen een chemische reactie waarbij elektronen tussen moleculen worden overgedragen.

Het team verving systematisch segmenten in het inactieve klasse-II-eiwit door overeenkomstige segmenten uit de actieve klasse-I-eiwitten en vice versa. Het opvallendste fysische verschil tussen de twee klassen is een verlengde lus in de inactieve klasse II-eiwitten. Nadat de onderzoekers de lange lus hadden weggesneden en vervangen door de kortere lus uit een eiwit van klasse I, konden ze een licht verhoogde katalytische activiteit waarnemen. In combinatie met andere mutaties nam de activiteit van het klasse-II-eiwit echter progressief toe. De onderzoekers concludeerden dat de lange lus als een schakelaar werkt in de inactieve klasse II en dat de invoering van alle vier mutaties uit glutaredoxines van klasse I nodig was om het inactieve eiwit volledig om te vormen tot een actief eiwit. Uiteindelijk slaagden ze erin inactieve eiwitten, die normaal de taak hebben om ijzer-sulfide-kringen te herkennen of over te dragen, om te zetten in actieve enzymen die redoxreacties katalyseren, en vice versa.

“Mutaties in alle vier de gebieden werken samen om het eiwit ofwel in een actieve redox-katalysator ofwel in een ijzervormend eiwit te veranderen,” verduidelijkte Marcel Deponte.

Het biochemieteam uit Saarland onder leiding van professor Bruce Morgan ontwikkelde vervolgens een assay om de relevantie van de mutaties in levende gistcellen te testen en bevestigde daarbij hetzelfde resultaatpatroon - alle vier de mutaties zijn nodig voor de volledige overgang tussen de twee klassen. Voor deze analyses gebruikten de onderzoekers een groene fluorescerende sond, die van kleur verandert zodra ze redoxreacties detecteert. Het gewijzigde licht van de fluorescerende sond gaf aan in hoeverre een mutatie het eiwit in staat stelde om redoxreacties binnen de cellen te katalyseren.

In de tussentijd voerde de door professor Holger Gohlke uit Düsseldorf geleide groep voor computationele farmaceutische chemie en moleculaire bio-informatica moleculardynamische simulaties uit met supercomputers, die de resultaten eveneens bevestigden en aanvulden.

Samengevat bieden de drie onderzoekslijnen “een echt overtuigend beeld van de werking van deze eiwitten,” zegt Marcel Deponte. “Dit resultaat is mogelijk gemaakt door een Schwerpunktprogramma van de Deutsche Forschungsgemeinschaft, dat dit soort samenwerking stimuleert,” voegde hij toe met uitleg.

De volgende stappen zouden kunnen bestaan uit het onderzoeken van de effecten van deze mutaties op menselijke cellen of het toepassen van een soortgelijk onderzoeksproces op andere eiwitten. Dankzij de vooruitgang in genetische sequentietechnologie zijn duizenden eiwitten ontcijferd, terwijl wetenschappers tot nu toe slechts in de beginfase zijn van het begrijpen wat deze eiwitten doen of hoe ze werken.

Oorspronkelijke publicatie:

M. Deponte et al., “Quantitative assessment of the determinant structural differences between redox-active and inactive glutaredoxins,” Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-020-15441-3 (04/2020)