Rozhodující mutace

Schématické znázornění čtyř funkčně určujících strukturálních rozdílů mezi enzymaticky aktivními a neaktivními glutaredoxiny.

Porovnání čtyř funkčně určujících strukturálních rozdílů mezi enzymaticky aktivními a neaktivními glutaredoxiny.

Němečtí vědci dokázali určit přesné strukturální rozdíly, které rozhodují o tom, zda se protein stane aktivním enzymem nebo zařízením pro železité ionty. Toto poznání, o němž informuje odborný časopis Nature Communications, nabízí hlubší pohled na základní buněčné procesy, jako je syntéza DNA a železité metabolismus.

Čtyři mutace v skupině proteinů nazývaných glutaredoxiny určují, jak tyto proteiny fungují v různých oblastech, od bakterií, kvasinek, rostlin až po člověka, uvádí vědci v časopise Nature Communications.

„Tyto proteiny jsou klíčové pro životně důležité metabolické cesty,“ vysvětlil profesor Marcel Deponte, který jako biochemik vedl výzkum na Technické univerzitě Kaiserslautern. „Získané poznatky o těchto proteinech rozšiřují naše základní porozumění tomu, jak život funguje.“

Existují dvě hlavní třídy glutaredoxinových proteinů. Glutaredoxiny třídy I jsou enzymy, které katalyzují důležité redox reakce, například syntézu výchozích sloučenin DNA. Glutaredoxiny třídy II nejsou aktivními katalyzátory, ale slouží jako přenašeče a senzory železo-síťových klastrů, které hrají důležitou roli v železitých metabolických procesech.

Zatímco biochemici tyto dvě třídy znají již více než 20 let, dosud nebylo jasné, jaké strukturální rozdíly jsou zodpovědné za jejich odlišné funkce. Marcel Deponte se spojil s vědci z Univerzity Saarland a Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, aby zkoumali proteiny v zkumavce, v buňkách kvasinek a pomocí počítačových modelů.

Strukturální analýzy pomocí jaderné magnetické rezonance odhalily čtyři oblasti, které obsahovaly rozdíly nebo mutace mezi aminokyselinovými sekvencemi třídy I a třídy II. Marcel Deponte a jeho tým chtěli přesně vědět, jak moc každá mutace přispívá k tomu, že protein je buď katalyticky aktivní glutaredoxin třídy I, nebo neaktivní glutaredoxin třídy II.

Pro měření toho použili kombinaci modifikačních a sledovacích technik. V prvním kroku byly proteiny vyrobeny a očištěny, aby bylo možné analyzovat jejich aktivitu v zkumavkovém testu. Obvykle by aktivní enzym třídy I katalyzoval nebo podporoval redox reakci, tj. chemickou reakci přenosu elektronů mezi molekulami.

Tým systematicky nahradil části neaktivního proteinu třídy II odpovídajícími částmi z aktivních proteinů třídy I a naopak. Nejvýraznějším fyzikálním rozdílem mezi těmito dvěma třídami je prodloužená smyčka v neaktivních proteinech třídy II. Po odstranění této dlouhé smyčky a jejím nahrazení kratší smyčkou z proteinu třídy I mohli vědci pozorovat mírně zvýšenou katalytickou aktivitu. V kombinaci s dalšími mutacemi se aktivita proteinu třídy II postupně zvyšovala. Výzkumníci dospěli k závěru, že dlouhá smyčka působí jako vypínač v neaktivní třídě II a že zavedení všech čtyř mutací z proteinů třídy I je nutné k úplné přeměně neaktivního proteinu na aktivní. Nakonec se jim podařilo přeměnit neaktivní proteiny, jejichž úkolem je obvykle rozpoznávat nebo přenášet železo-síťové klastery, na aktivní enzymy katalyzující redox reakce, a naopak.

„Mutace ve všech čtyřech oblastech působí společně, aby protein přeměnily buď na aktivní redox katalyzátor, nebo na železo-vázající protein,“ vysvětlil Marcel Deponte.

Biochemický tým ze Saarlandu pod vedením profesora Bruce Morgana následně vyvinul test, který měl ověřit význam mutací v živých buňkách kvasinek, a potvrdil stejný vzorec výsledků – všechny čtyři mutace jsou nezbytné pro úplný přechod mezi oběma třídami. Pro tyto analýzy vědci použili zelenou fluorescenční sondu, která mění svou fluorescence, jakmile detekuje redox reakce. Změněné světlo fluorescenční sondy signalizovalo, do jaké míry mutace umožnila proteinu katalyzovat redox reakce uvnitř buněk.

Mezitím skupina vedená profesorem Holgerem Gohlkem z Düsseldorfu provedla molekulárně-dynamické simulace pomocí superpočítačů, které výsledky rovněž podpořily a doplnily.

Celkově tři výzkumné řady „představují opravdu přesvědčivý obraz fungování těchto proteinů,“ říká Marcel Deponte. „Toto zjištění bylo umožněno díky specializovanému programu Německé výzkumné společnosti, který podporuje takovou spolupráci,“ dodal vysvětlujíc.

Dalším krokem by mohlo být zkoumání dopadů těchto mutací na lidské buňky nebo aplikace podobného výzkumného procesu na jiné proteiny. Díky pokroku v genetické sekvenační technologii bylo rozluštěno tisíce proteinů, přičemž vědci zatím jen částečně pochopili, co tyto proteiny dělají nebo jak fungují.

Původní publikace:

M. Deponte et al., „Kvantitativní hodnocení determinantních strukturálních rozdílů mezi redox aktivními a neaktivními glutaredoxiny“, Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-020-15441-3 (04/2020)