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Author
John Cobb

Ein innovativer Luftkeimsammler für kontinuierliches Keimmonitoring mit minimalem Plattentausch

Abbildung 2: Freistehender ISO-90-Probenahmekopf, der sich an einem Probenahmeort in einem Grade A-Bereich befindet (links) und über einen Vakuumschlauch und eine elektrische Verbindung durch eine leicht zugängliche Stopfbuchse mit einer ISO-CON-Steuereinheit verbunden ist, die sich außerhalb des Grade A-Bereichs befindet (rechts). Eine Reihe von Verschraubungen und Edelstahlständern sind für eine Vielzahl von Installationen erhältlich.
Abbildung 2: Freistehender ISO-90-Probenahmekopf, der sich an einem Probenahmeort in einem Grade A-Bereich befindet (links) und über einen Vakuumschlauch und eine elektrische Verbindung durch eine leicht zugängliche Stopfbuchse mit einer ISO-CON-Steuereinheit verbunden ist, die sich außerhalb des Grade A-Bereichs befindet (rechts). Eine Reihe von Verschraubungen und Edelstahlständern sind für eine Vielzahl von Installationen erhältlich.
Abbildung 1: Zwei alternative Optionen für den ISO-90-Kopf: a) montiert auf dem Sockel mit Sanitärflanschanschluss zur schnellen Entriegelung (links); und b) freistehend (rechts)
Abbildung 1: Zwei alternative Optionen für den ISO-90-Kopf: a) montiert auf dem Sockel mit Sanitärflanschanschluss zur schnellen Entriegelung (links); und b) freistehend (rechts)

Die aktuelle Version des Annex 1 des Leitfadens für gute Herstellungspraxis (Annex 1: Manufacture of Sterile Products) bringt signifikante Änderungen im Bezug auf die vorangegangene Version mit sich. Diese beinhalten die Anforderung eines kontinuierlichen mikrobiologischen Luftkeimmonitorings in Grade A-Bereichen während der gesamten Dauer kritischer Prozessschritte, wie beispielsweise der Bereitstellung von Prozessmaterialien und Abfülloperationen.

Zusätzlich dazu besteht ebenfalls die Anforderung, jegliche koloniebildenden Einheiten (KBE) zu untersuchen und zu identifizieren. Weiterhin muss der mögliche Einfluss der Mikroorganismen auf die Produktqualität der jeweiligen Chargen sowie insgesamt der Zustand der Prozesskontrolle ermittelt und als Teil eines dokumentierten Systems geprüft werden.

Im Folgenden wird ein innovatives Design für einen aktiven Luftkeimsammler beschrieben, welches es ermöglicht, bei hoher biologischer Effizienz bis zu vier Stunden mit nur einer TSA-Platte (engl.: „Trypticase Soy Agar“) in kritischen Prozessbereichen mit minimaler menschlicher Intervention zu sammeln.

Diese Methode der aktiven Luftkeimsammlung kann Standardverfahren wie beispielsweise Sedimentationsplatten ergänzen, bzw. vollständig ersetzen, um dadurch eine genauere zeitliche Auflösung der Luftkeimsammlung zu ermöglichen während der gesamten Dauer von Produktionsprozessen zu erhalten .

Einleitung

Die Produktion in Reinräumen dient dazu, den Anteil an mikrobiologischen Kontaminationen zu kontrollieren, bzw. diesen zu limitieren, um das Risiko auf die Produktqualität und somit die Gesundheit von Patienten und Verbrauchern zu minimieren.
Um die Kontrolle über mikrobiologische Kontaminanten in Grade-A-Reinräumen, Isolatoren oder RABS (engl.: Restricted Access Barrier Systems”) zu erlangen, besteht die Notwendigkeit eines gewissen Verständnisses über den Ursprung bzw. den Quellen der Kontamination.

Die Auswahl von geeigneten Methoden zur Bewertung der Präsenz von mikrobiellen Organismen mit den dazugehörigen Risiken sollte für individuelle Prozesse und Anlagen genau analysiert werden, um anschließend die geeignetste Lösung zu finden und diese in ein validiertes Monitoringsystem einzubinden.

Bei der mikrobiologischen Überwachung ist es wichtig, sich auf aktuelle Regularien zu beziehen und diese während des gesamten sterilen Produktionsprozesses zu berücksichtigen. Traditionell werden in mikrobiellen Risikoanalysen in der pharmazeutischen Industrie nur Momentaufnahmen von mikrobiologischen Kontaminanten in Prozessen gemacht, jedoch wäre es für das verlässliche Verständnis von Prozessen in kritischen Prozessumgebungen sinnvoller, diese Analysen kontinuierlich während des gesamten Prozesses durchzuführen.

Kontinuierliches mikrobiologisches Monitoring mit einer validierten Methode kann zu einem genaueren Verständnis von kritischen Prozessen führen, um so Rückschlüsse auf die mikrobielle Kontamination zu ziehen und das Risiko durch die Anwesenheit solcher abzuschätzen.

Die folgenden Bereiche werden in dieser Ausführung weiter erläutert:

– Aktuelle Standards die Auswahl von aktiven Luftkeimsammlern (engl.: Active Air Sampler; AAS) betreffend
– Verschiedene AAS Designs/Methoden
– Vor- und Nachteile beim Design eines AAS für den Einsatz in Grade A-Bereichen
– Einführung eines neuen „Slit-to-agar“-Designs inkl. Validierungsergebnissen

Aktuelle Standards bezüglich der Wahl der am besten geeigneten AAS als Teil eines Monitoringsystems

Es gibt 3 wichtige Normen/Regelungen, die zu berücksichtigen sind:

ISO 14698-1:2003¹

Diese Norm ist dabei, von CEN 17141 abgelöst zu werden. Ein zentraler Teil bezüglich aktiver Luftkeimsammler ist jedoch enthalten. Diese ISO-Norm beschreibt die Notwendigkeit eines Luftkeimsammlers lebensfähige Partikel auf einem geeigneten Kulturmedium effizient erfassen zu können, und zwar sowohl aus Sicht der biologischen als auch der physikalischen Effizienz. Außerdem sind hierzu Validierungsmethoden beschrieben.

Der biologische Wirkungsgrad ist die Fähigkeit eines AAS, mikrobielle Partikel effizient mit minimaler Austrocknung oder Scherung der Mikroorganismen durch die Geschwindigkeit der Luft, die durch den Sammelschlitz oder das Sieb kommt, zu sammeln. Auch der Trocknungseffekt auf das gewählte Kulturmedium muss berücksichtigt werden. Falls das Medium während der Luftkeimsammlung austrocknet, ist kein Wachstum gewährleistet.

Der physikalische Wirkungsgrad ist die Fähigkeit eines AAS, mikrobielle Partikel unterschiedlicher Größe effizient zu sammeln. Mehrere Faktoren beeinflussen die physikalische Effizienz. Darunter sind die Geometrie des Kopfes, die Länge und Breite des Schlitzes oder der Durchmesser und die Anzahl der Löcher im Impaktor-Probenahmekopf. Ein weiterer wichtiger Faktor, der berücksichtigt werden muss, ist die Geschwindigkeit der auftreffenden Luft und die Genauigkeit des Spalts zwischen dem Probenahmekopf und der Oberfläche der Agarplatte.

Innerhalb der ISO 14698-1 gibt es einige Hinweise (jedoch  keine spezifischen Entwürfe) über die Spezifikationen eines AAS zur Implementierung in einen Grade A-Bereich:

– Sollte in der Lage sein, in angemessener Zeit genügend Luftproben zu nehmen (Minimum von einem Kubikmeter Luft, die in einigen Minuten bei höchstem Volumenstrom und bis zu 4 Stunden auf der langsamsten Stufe beprobt werden)
– Sollte in der Lage sein, effizient Proben bis zu Partikeln von 1 µm zu nehmen (d50 ²-Wert von 1µm oder kleiner), was bedeutet, dass die Hälfte der 1 µm Partikel gesammelt wird.
– Die Abluft sollte die unidirektionale Luftströmung des Raumes nicht stören, d.h. die Abluft sollte aus der Umgebung weggeführt oder abgeleitet werden.
– Der AAS sollte die Umgebung nicht verunreinigen, d.h. die Abluft sollte weggeleitet oder durch einen geeigneten HEPA-Filter strömen.

EN 17141: 2020³

Ab ihrer Veröffentlichung wird diese europäische Norm die ISO 14698 in Europa ersetzen. Sie berücksichtigt moderne Entwicklungen und Praktiken. Insbesondere in Bezug auf AAS betont sie die Bedeutung der biologischen Effizienz und die Notwendigkeit einer angemessenen Sammeleffizienz für den zu prüfenden Bereich. Ein wichtiger Punkt, den es zu beachten gilt, ist die Bedeutung, wenn die Norm in Verbindung mit Anhang 1 gelesen wird. Grundsätzlich kann dies so interpretiert werden, dass ein AAS einen d50-Wert von kleiner als 1 µm in Verbindung mit einem hohen biologischen Wirkungsgrad haben muss, um "kein Wachstum" genau zu erkennen, da sonst das Risiko besteht, dass bestenfalls eine Chance von 50% besteht, alle 1 µm großen Partikel zu sammeln.

EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Products (Revision 12 Februar 2020)⁴

Abschnitte 9.24 bis 9.33 (Environmental and personnel monitoring – viable particles) sind für Monitoringsysteme und die Wahl der geeigneten Methoden relevant.

Von besonderem Interesse sind die Abschnitte 9.27, 9.29 und Tabelle 7 in 9.30, welche im Folgenden zitiert werden:

9.27 Continuous viable air monitoring in the Grade A zone (e.g. air sampling or settle plates) should be undertaken for the full duration of critical processing, including equipment (aseptic set-up) assembly and filling operations. A similar approach should be considered for Grade B cleanrooms 1977 based on the risk of impact on the aseptic processing. The monitoring should be performed in such a way that all interventions, transient events and any system deterioration would be captured and any risk caused by interventions of the monitoring operations is avoided.

9.29 Sampling methods and equipment used should be fully understood and procedures should be in place for the correct operation and interpretation of results obtained. The recovery efficiency of the sampling methods chosen should be qualified.

9.30 Action limits for viable particle contamination are shown in Table 7 [of Annex 1].
Table 7: Maximum action limits for viable particle contamination

Grade

Air sample

 cfu/m3

Settle plates (diam. 90 mm) cfu/4 hours (a)

Contact plates (diam. 55mm), cfu/ plate (c)

Glove print,

 Including 5 fingers on both hands cfu/ glove

A

No growth (b)

B

10

5

5

5

C

100

50

25

-

D

200

100

50

-

(a) Settle plates should be exposed for the duration of operations and changed as required after 4 hours (exposure time should be based on validation including recovery studies and it should not have any negative effect on the suitability of the media used). Individual settle plates may be exposed for less than 4 hours.
(b) It should be noted that for Grade A, any growth should result in an investigation.

Die obige Anmerkung (a) bietet die Möglichkeit, den Ersatz von Sedimentationsplatten durch einen AAS in Betracht zu ziehen, der 4 Stunden lang auf einer einzigen Platte sammeln kann, was einer normalen Belastung auf einer Sedimentationsplatte entspricht, jedoch mit einer wesentlich besseren Sammeleffizienz (mehr als 10-fach).

Verschiedene aktive Luftkeimsammler (Designs und Methoden)

Es gibt eine Reihe von verschiedenen AAS-Methoden, die sich entwickelt haben. Die am häufigsten verwendeten sind:
a) Zentrifugal - verwendet Agarstreifen. Dieser Luftkeimsammler verursacht übermäßige Turbulenzen und die Streifen erfordern eine Manipulation des Geräts für die Inkubation. Nicht relevant für Grade A-Bereiche.

b) Filtration - verwendet eine Gelatine-Filtermembran, um Partikel aus der Umgebung einzufangen. Nach der Probenahme muss die Gelatinemembran aseptisch auf eine Petrischale mit TSA aufgebracht werden, wo sie sich auflöst und die eingeschlossenen Partikel auf das Medium zur Bebrütung freigibt. Diese Manipulation bedeutet, dass diese Methode nicht für Grade A-Bereiche geeignet ist.

c) Siebimpaktor - verwendet einen festen Probenahmekopf, der (typischerweise) 2,5 mm über der Oberfläche einer TSA-Platte positioniert ist. Es kann sich um eine Siebplatte mit normalerweise 300 kleinen Löchern oder einer Reihe von radialen Schlitzen handeln, wobei die Abmessungen der Öffnung so ausgelegt sind, dass eine ausreichende Geschwindigkeit erreicht wird, um einen d50-Wert bis zu 1 µm zu erhalten. Es gibt eine Reihe von Luftstromgeschwindigkeiten, die von verschiedenen Siebsammlern verwendet werden. Sie reichen von einem Kubikfuß pro Minute (entspricht 28,3 Litern pro Minute), der 35 Minuten und 20 Sekunden für die Probenahme von einem Kubikmeter benötigt, bis zu 100 Litern pro Minute, die 10 Minuten für die Probenahme eines Kubikmeters benötigen. Einige Siebprobennehmer sind bei deutlich höheren d50-Werten (z. B. >10 µm) wesentlich weniger effizient und sollten nur für Trendanalysen eingesetzt werden, wenn deutlich höhere Zahlen zu erwarten sind.

Ein Siebimpaktor ist ein Intervall-Luftkeimsammler, d.h. dass die Medienplatte nach jedem Kubikmeter Luft gewechselt werden muss.

Da die Luft auf die gleichen festen Positionen auf der Agaroberfläche auftrifft, kommt es an diesen Stellen zu einer natürlichen Austrocknung des Mediums und die getroffenen Partikel können austrocknen, was die biologische Effizienz verringert.

Als Technik bedarf es einer sorgfältigen Qualifizierung, wenn die Absicht besteht, einen Siebsammler in Grade A-Bereichen zu verwenden. Die Probe ist jedoch nur eine Momentaufnahme der keimbelasteten Luft zum Zeitpunkt der Probenahme. Jede koloniebildende Einheit ist signifikant, wobei jedoch ein negatives Ergebnis irreführend sein kann, da es durchaus lange Intervalle geben kann, in denen keine Proben genommen werden.

Für Bereiche, in denen eine höhere Anzahl von Organismen erwartet wird (Grade C/D-Bereiche) oder nicht klassifizierte Bereiche, ist das eine gute Methode für die Trendbestimmung.

Siebimpaktoren können batterie- oder netzbetrieben sein oder in eine Anlage eingebaut werden. Sie können auch mit der Probenahmesonde an der gewählten Probenahmestelle positioniert werden, wobei die Bedienelemente und die Vakuumquelle an einer sicheren Position außerhalb des reinen Bereiches sind.

d) „Slit-to-agar"-Luftkeimsammler - Optimale Methode für die kritischsten, risikobewerteten Bereiche in Grade A. Diese Probenehmer haben einen festen radialen Schlitz im Probenahmekopf, der über einer Agarplatte positioniert ist, die sich über eine vom Benutzer gewählte Zeit um bis zu 360 Grad dreht. Die Luft wird kontinuierlich auf einen frischen Teil der Agar-Oberfläche aufgebracht, so dass ein d50-Wert von kleiner 1 µm durchgehend aufrechterhalten werden kann. Diese AAS haben den zusätzlichen Vorteil einer ausgezeichneten biologischen Effizienz, da ständig frisches Medium mit der Luft beaufschlagt wird. Diese Methode ermöglicht auch die Anbringung einer isokinetischen Sonde über der Schlitzbaugruppe, so dass in bestimmten Situationen der Probenahmekopf bis zu 8 Fuß von der kritischen Probenahmestelle entfernt werden kann. Die neuesten Geräte können mit Batterie/Netzbetrieb oder Power-over-Ethernet (PoE) betrieben werden, oder sie können in ein kundenspezifisches Softwaresystem oder ein Facility Management System (FMS) eingebaut werden, wobei die Steuerung und die Vakuumquelle ferngesteuert sind.

Konstruktionsanforderungen für einen AAS für Grade-A-Umgebungen

1. Wenn ein Luftkeimsammler einen d50-Wert von 1 µm hat, besteht nur eine Chance von 50 %, dass er auf einen Organismus von 1 µm trifft. Die letzte Revision des Annex 1 gibt ein Ziel von Nullwachstum vor. Daher sollte der d50-Wert eines Luftkeimsammlers in Grade A-Bereichen kleiner als 1 µm sein. Als Richtlinie, um dies zu erreichen, sollte die Luftgeschwindigkeit zwischen dem Schlitz oder der Öffnung im Probenahmekopf bis zur Impaktionsstelle auf der Agaroberfläche nicht unter 30 m/s fallen, kann aber deutlich höher sein, vorausgesetzt, dass die biologische Effizienz nicht abfällt.
2. Der biologische Wirkungsgrad sollte hoch sein. Die Beibehaltung eines genauen und gleichmäßigen Spaltes zwischen Spalt und Agaroberfläche (typischerweise 2,5 mm) ist wichtig, da sonst die Impaktionsraten erheblich variieren. Die Art des Mediums, das Füllvolumen und der Feuchtigkeitsgehalt des Agars spielen ebenfalls eine Rolle. Der Luftstrom muss kontinuierlich auf frisches Medium treffen.
3. Die Sammeleffizienz eines AAS sollte dem Grad des zu prüfenden Bereichs angemessen sein.
4. Eine Möglichkeit, längere Zeit auf einer einzigen Platte zu beproben, bevor diese gewechselt werden muss, ist wünschenswert. Eine Sedimentationsplatte wird typischerweise für maximal 4 Stunden verwendet, daher sollte dieser Wert das Ziel für einen AAS sein. Dies ermöglicht eine aussagekräftigere Überwachung über einen gesamten Prozessverlauf, anstatt nur eine Momentaufnahme zu nehmen, die wenig aussagekräftige Informationen über die Luftqualität während kritischer Prozessschritte liefert.
5. Es ist wichtig, die menschliche Intervention so gering wie nötig zu halten, da ein Plattentausch immer ein Sterilitätsrisiko bedeutet.
6. Die verwendeten Medien können stark variieren. Das bedeutet, dass eine sorgfältige Validierung und regelmäßige GMP-Compliance-Audits des Herstellers und seiner internen Methoden, Kontrollen und SOPs erforderlich sind.

Die folgenden Überlegungen gelten für Medien:

a) Typischerweise wird routinemäßig gammabestrahltes TSA und bei Verdacht auf Schimmelpilze zusätzlich Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) verwendet. Beide werden in 9 cm Petrischalen verwendet.
b) Es sind verschiedene Agarplatten-Füllvolumina erhältlich (typischerweise 18ml, 25ml und 32ml). Die genauen Füllvolumina können jedoch bei unterschiedlichen Herstellern variieren.
c) Der Feuchtigkeitsgehalt der Platten kann variieren. Bei Raumtemperatur gelagerte, dreifach gewickelte und hermetisch verschlossene Packungen halten die Feuchtigkeit im Agar besser zurück als die originalen, atmungsaktiv verpackten Platten. Es ist wichtig, frische Platten mit dem maximalen Grad an zurückgehaltener Feuchtigkeit zu verwenden, um die Leistung zu optimieren.
d) Verschiedene Hersteller verwenden unterschiedliche Stufen der Gammabestrahlung (12 bis 25 kGy), um ihre Platten terminal zu sterilisieren. Dies hat erhebliche Auswirkungen auf die Fertilität, die Gelfestigkeit und die Feuchtigkeitsspeicherung der Medien. Eine höhere Gelfestigkeit hält mehr Feuchtigkeit zurück, reduziert aber die Fertilität einer Platte. Die gewählte Platte eines auditierten Herstellers muss bei Challenge-Tests innerhalb jeder einzelnen Charge eine konsistente Fertilität aufweisen und auch eine akzeptable Schwankung von Charge zu Charge aufweisen.
e) Nach der Impaktion wird eine Medienplatte insgesamt 5 Tage lang bebrütet: entweder 2 Tage bei 30 bis 35 °C, gefolgt von 3 Tagen bei 20 bis 25 °C oder 5 Tage lang bei 30 bis 35 °C, um das Wachstum von Umwelt- und vom Menschen stammenden (Bediener) Organismen zu ermöglichen. Die PQ-Validierung eines AAS muss nachweisen, dass eine Platte noch genügend Feuchtigkeit und Fruchtbarkeit aufweist, um die betroffenen Organismen über die gesamte gewählte Probenzeit wachsen zu lassen.

Einführung des ImpactAir ISO-90, ein neues Slit-to-Agar-Design

Wichtigste Konstruktionsmerkmale

Die wichtigsten Konstruktionsmerkmale des neuen Geräts sind:

a) Slit-to-Agar AAS unter Verwendung einer 9cm-Agarplatte.
b) Werkseitig austauschbare Schlitzbaugruppen. Alle Schlitze sind 22 mm lang, die Breite kann von 0,1 mm bis 0,8 mm gewählt werden.
c) Variable Durchflussraten (in Liter pro Minute): 5, 10, 15, 28,3 (1cfm), 50 und 70.
d) Erreichte d50-Werte von 0,46 µm bis 0,95 µm.
e) Kann einen Kubikmeter Luft oder 4 Stunden lang kontinuierlich auf einer einzigen Platte sammeln, wobei bei entsprechendem Aufbau typischerweise 3 oder 4 Kubikmeter Luft beprobt werden.
f) Die biologische Effizienz wird stark verbessert, was besonders wichtig ist, wenn ein Aufbau mit einem d50 < 1 µm verwendet wird. Ermöglicht längere Probenahmezeiten.
g) Zu den Ausführungsoptionen gehört ein eigenständiges Gerät, das über Netz, Batterie/Netz oder Power over Ethernet (POE) betrieben wird. Auch eine Remote-Einheit, die von einer externen Vakuumquelle und -steuerung gespeist wird und außerhalb der reinen Zone positioniert ist, kann optional in das Laborinformationsmanagementsystem (LIMS) des Kunden, ein maßgeschneidertes lokales System oder ein Facility Management System (FMS) integriert werden.

Tabelle 1 zeigt die Auswirkung der Variation der Spaltabmessungen und der Änderung der Luftdurchflussraten durch den Probenahmekopf auf das Volumen der gesammelten Luft über längere Probenahmezeiten von bis zu 4 Stunden auf einer einzelnen Platte. Dies wird unter Beibehaltung hoher Impaktionsgeschwindigkeiten erreicht, die eine d50-Leistung von deutlich unter 1 µm liefern.

Tabelle 1: Die Auswirkung verschiedener Spaltabmessungen und verschiedener Luftdurchflussraten auf die d50-Werte und das Volumen der gesammelten Luft

Schlitz-breite (mm)

Durchfluss-rate (LPM)

d50

(µm)

Impaktions-geschwindigkeit (m/s)

1m3 Zeit (min)

1 h Vol. (m3)

2 h Vol.

(m3)

3 h Vol.

(m3)

4 h Vol.

(m3)

0.1

5

0.46

38

200

0.3

0.6

0.9

1.2

0.2

5

0.92

19

200

0.3

0.6

0.9

1.2

0.2

10

0.65

39

100

0.6

1.2

1.8

2.4

0.2

15

0.53

57

66.7

0.9

1.8

2.7

3.6

0.3

15

0.80

38

66.7

0.9

1.8

2.7

3.6

0.4

29

0.76

55

34.5

1.74

3.48

5.22

6.96

0.6

50

0.87

63

20

3

6

9

12

0.8

75

0.95

71

13.3

4.5

9.0

13.5

18

Anmerkungen:

  1. Die olivgrüne Reihe wurde vom Kunden getestet (siehe Testergebnisse unten)
  2. Der gelbe Kasten wird nicht als Aufbau empfohlen, die Angaben dienen nur zur Veranschaulichung

Erste Validierungstests

Erste Validierungstests wurden von einem Kunden in einem kontrollierten Laborbereich durchgeführt und auf einer kürzlich stattgefundenen Konferenz⁵ vorgestellt. Für die Tests wurden vier verschiedene AAS verwendet. Einer davon war ein Referenzprobenehmer des Kunden für Grade A-Bereiche:

– ImpactAir-140 (14 cm TSA-Platte), Slit-to-Agar Sampler - Referenzluftkeimsammler.
– ImpactAir ISO-90 Head (9 cm TSA-Platte) mit ISO-CON Vakuumquelle inkl. Touchscreen - das neue Design des Slit-to-Agar-Luftkeimsammlers.
– Siebimpaktor A (9 cm TSA-Platte) – Einsatz in Grade A-Bereichen
– Siebimpaktor B (9 cm TSA-Platte) – Einsatz in Grade A-Bereichen

Der Referenz-Probenehmer wurde unabhängig gegen seinen eigenen Standard-Probenehmer bei Public Health England, Porton Down, einem ISO 14698 Testhaus, getestet und erwies sich als 25 % effizienter. Er wird auch routinemäßig in den kritischen Grade A-Bereichen des Kunden eingesetzt.

Das neue Design des Probenehmers besteht aus einem ISO-90-Probenahmekopf, der in Verbindung mit einer ISO-CON-Steuereinheit arbeitet. Letztere umfasst eine Vakuumquelle, einen Touchscreen und eine HEPA-gefilterte Absaugung (nur erforderlich, wenn der ISO-CON in Grade A-Bereichen positioniert werden muss).

Die ISO-CON-Einheit steuert die Durchflussrate, die Zeit und andere Benutzerfunktionen (z.B. Bedienerdetails, Standort und Laufdaten) über den Touchscreen und beinhaltet den Datenspeicher. Die Durchflussrate reicht von 5 LPM bis 100 LPM. Niedrigere Raten von 5 LPM oder 10 LPM haben einen d50 von ca. 0,5 µm, indem sie das Austrocknen des Kulturmediums minimieren und somit längere Probenahmen auf einer einzelnen Platte ermöglichen (bis zu 4 Stunden). Eine höhere Durchflussrate von 100 LPM würde eine 1-m3 Probe in 10 Minuten nehmen, jedoch müsste die Platte nach der 1-m3 Probe gewechselt werden, da das Medium schneller austrocknet.

Die Abbildungen 1 und 2 zeigen Abbildungen des neuen Probenehmers, bestehend aus dem ImpactAir-Probenahmekopf ISO-90 und der Steuereinheit ISO-CON.

Die Testprozedur bestand darin, dass der Referenzsammler und die drei zu bewertenden Probenehmer gleichzeitig für 20 Minuten an jeder der vier Probenahmestellen im Abstand von mehreren Metern getestet wurden.

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die durchschnittliche Zählung pro Standort, die den Durchschnitt aller vier Probenehmer darstellt, eine vernachlässigbare Abweichung von 5 % zwischen den maximalen und minimalen Zählungen zeigt, was darauf hindeutet, dass die Testumgebung während des gesamten Testzeitraums konstant blieb. Die Platten wurden nach 5 Tagen Inkubation bei 30 bis 35°C auf koloniebildende Einheiten pro Kubikmeter Luft (KBE/m3) gezählt. Die Ergebnisse wurden normalisiert, um die Zählungen pro Kubikmeter beprobter Luft zu vergleichen. Eine 9 cm-Sedimentationsplatte wurde ebenfalls an jedem Standort für 20 Minuten parallel zu den Luftprobenahmen exponiert.

Tabelle 2: Durchschnittliche Zählungen pro Probenahmeort und normalisierte Zählungen in KBE/m3 nach Art des Luftkeimsammlers

Luftkeimsammler

Ort und KBE/Platte

 

Durchschnitt KBE

Normaliserte

KBE/m3

1

2

3

4

 Referenzsampler

 

44

83

71

37

59

105

Neuer Sampler

 

41

34

39

41

39

130

Siebimpaktor A

 

70

71

66

103

78

78

Siebimpaktor B

 

71

47

63

47

57

57

Kontrolle

 

5

3

3

0

3

-

Durschnitt (KBE/Ort)

57

59

60

57

-

-

 

Die biologische Effizienz, die relative Rückgewinnungsrate und die Sammeleffizienz der drei getesteten Probenehmer wurden mit dem Referenzprobenehmer verglichen. Wenn die vom Referenzsammler pro m3 Luft zurückgewonnenen Zählungen als absoluter Wert von 1 angenommen werden, dann sind die relativen Rückgewinnungsraten der drei getesteten Probenehmer in Tabelle 3 dargestellt. Der neue Slit-to-Agar-Probenehmer hatte eine relative Rückgewinnungsrate, die 1,3-mal besser war als der Referenz-Probenehmer und 1,8-mal bzw. 2,4-mal besser als die Siebimpaktoren A und B.

Die biologische Sammeleffizienz für den Referenz-Probenehmer wurde von einem unabhängigen Testinstitut (PHE, Porton Down) im Vergleich zu ihrem Casella Standard-Slit-Probenehmer unter Verwendung der in ISO 14698-1 beschriebenen Methode bestimmt und betrug 125 %. Anhand der relativen Wiederfindungswerte wurden vernünftige Schätzungen der Sammeleffizienzen für die drei anderen Geräte beim Betrieb in einer natürlichen Umgebung ermittelt. Die Werte sind in Tabelle 3 dargestellt.  

Tabelle 3: Vergleich der relativen Wiederfindungsraten und Sammeleffizienzen der vier Probenehmer

Luftkeimsammler

Beschreibung

Luftstrom

(LPM)

Strömungs-geschwindigkeit (m/s)

Zeit für 1 m3 (min)

d50  (µm)

Biologischer Wirkungsgrad (% ISO 14698 Test Lab Sampler)

Relative Rückgewinnungs-rate

Berechnete

Sammeleffizienz

Referenzsampler

Slit-to-Agar

Single slit

0.152 x 44 mm

14 cm TSA

28.3

72

35.3

0.42

125

1.00

1.25

Neuer Sampler

 

Slit-to-Agar

Single slit

0.2 x 22 mm

9 cm TSA

15

56.8

66.7

0.53

Wird von unabhängigem Testzentrum bestimmt

1.30

1.63

Siebimpaktor A

Siebimpaktor

179 Löcher

Radius 0,375 mm

9 cm TSA

50

10.5

20.0

1.6

Wird von unabhängigem Testzentrum bestimmt

0.74

0.93

Siebimpaktor B

Siebimpaktor

300  Löcher

Radius 0,300 m

9 cm TSA

50

19.65

20.0

1.11

Wird von unabhängigem Testzentrum bestimmt

0.54

0.68

 

Weitere Überlegungen

Die Fähigkeit eines Luftkeimsammlers, luftgetragene Kontaminanten zu sammeln, kann anhand seiner Leistungsbewertung (PR) bestimmt werden. Die PR eines Luftkeimsammlers ist die Konzentration der Luftverschmutzung, die der Luftkeimsammler für eine definierte Luftkonzentration zurückgewinnen kann, und kann nach folgender Gleichung berechnet werden:

Performance Rating = n / (t *r * η)

n = Mindestanzahl von Mikroben, die erforderlich ist, um zu zeigen, dass der Probenehmer Mikroben bei der betrachteten Konzentration in der Luft messen kann
t = Samplingzeit (min)
r = Luftsammelrate (m3/min)
η = Sammeleffizienz des Samplers

Für einen EU Grade A-Bereich beträgt der Aktionsgrenzwert für mikrobielle Verunreinigungen in der Luft 1 KBE/m3. Bei einem Wert von 1 für n und unter Verwendung der berechneten Sammel-Effizienzen kann die PR für jeden Sampler wie in Tabelle 4 gezeigt berechnet werden. Es ist ersichtlich, dass der Referenzsampler und der neue Probenehmer in der Lage sind, luftgetragene Konzentrationen unter 1 KBE/m3 zu erfassen, die beiden üblicherweise verwendeten Siebimpaktoren jedoch nicht.

Tabelle 4: PR-Werte Luftkeimsammler

Luftkeimsammler

 

Performance Rating

(KBE/m3)

Referenzsampler

 

0.80

Neuer Sampler

 

0.61

Siebimpaktor A

 

1.08

Siebimpaktor B

 

1.47

 

Testfazit

Ein Vergleich der Anzahl der Luftkeime, die von den vier Luftkeimsammlern in der gleichen Umgebung gleichzeitig erfasst wurden, ergab, dass der neue Probenehmer eine 1,8- bzw. 2,4-mal höhere Wiederfindungsrate als Siebimpaktor A und Siebimpaktor B und auch eine 1,3-mal höhere Wiederfindungsrate als der Referenzprobenehmer aufweist. Wenn die Sammeleffizienzen aus diesen Informationen berechnet werden, können die Daten verwendet werden, um die Leistungsbewertung für jeden Probenehmer für den Einsatz in einer Umgebung mit einem Aktionsgrenzwert von 1 KBE/m3 für luftgetragene Kontamination zu bestimmen. Die Leistungsbewertungen sowohl für den Referenzsammler als auch für den neuen Probenehmer bestätigen, dass beide in der Lage wären, Kontaminationen unterhalb dieses Grenzwertes zu erkennen. Die Leistungsbewertungen für die Siebimpaktoren A und B zeigen jedoch, dass beide Geräte nicht in der Lage wären, Kontaminationen unterhalb dieses Grenzwertes zu erkennen. Daraus wird gefolgert, dass der Referenz-Probenehmer und der neue Probenehmer für die Überwachung in Bereichen der EU-Klasse Grade A geeignet wären, nicht aber die Siebimpaktoren A und B.

Allgemeines Fazit

Der ImpactAir ISO-90 ist ein innovativer aktiver Luftkeimsammler, der an kritischen, risikobewerteten Stellen innerhalb eines EU-Grade-A-Bereichs Proben nehmen kann und dabei allen Richtlinien gemäß ISO 14698-1, der kommenden EN 17141 und der neuesten Revision 12 des EG-GMP-Anhangs 1 entspricht. Das neue Design des Probenehmers hat einen hohen biologischen Wirkungsgrad und einen d50-Wert im Bereich von 0,5 µm (abhängig von den gewählten Spaltmaßen), was eine genaue Probenahme bis zu einer Partikelgröße von mindestens 1 µm in einem Bereich ermöglicht, in dem ein Nullwachstum nachgewiesen werden muss. Darüber hinaus kann der neue Luftkeimsammler bis zu 4 Stunden auf einer einzigen 9 cm-TSA-Platte laufen, was menschliche Eingriffe und die potenzielle Einführung mikrobieller Kontamination in kritischen Bereichen reduziert.

Eine mikrobiologische Überwachung während eines gesamten Produktionslaufs mit minimalem menschlichem Eingriff durch einen Plattenwechsel ist dadurch möglich und für die Verbesserung der Produktqualität und Patientensicherheit notwendig.

Allgemein lässt sich abschließend sagen, dass sich durch die hier beschriebene innovative Methode der aktiven Luftkeimsammlung traditionelle Methoden wie beispielsweise die passive Luftkeimsammlung durch Sedimentationsplatten ersetzen lassen.

Zum Autor:

John Cobb ist ein GMP-Mikrobiologe, der für die PMT (GB) Ltd. arbeitet. Er verfügt über mehr als 40 Jahre Erfahrung, einschließlich ursprünglicher Studien, der Durchführung von Gammabestrahlungsversuchen und der Beschaffung von für Reinräume der Klasse A geeigneten Verpackungen. Er hat führende Hersteller von Medien bei der Produktentwicklung beraten. Seit 1985 ist er auch an der Entwicklung von aktiven Luftkeimsammlern beteiligt und berät derzeit Kunden über die am besten geeigneten Sammler für ihre Grade-A-Einrichtungen.

Referenzen:

(1) ISO 14698-1: 2018 Cleanrooms and associated controlled environments—Biocontamination control, Part 1: General principles and methods. Geneva, Switzerland, International Organization for Standardization, 2003
(2) Ljungqvist B and Reinmüller B. Monitoring efficiency of microbiological impaction air samplers. European Journal of Parenteral Sciences 2008; 13: 93-97. (d50 value)
(3) EN 17141:2020 Cleanrooms and associated controlled environments - Biocontamination control (for final approval prior to publication)
(4) EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products, Revision 12 for consultation, 6th March 2020   
(5) Eaton T. Effective Risk Management of Microbial Contamination. London, UK. SMi ; Pharmaceutical Microbiology Conference. 2020.       

 


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